CRISPR

Sistema CRISPR-CAS9

Andrea Jurado y Soledad Romero

  • ¿Cómo funciona?

Empecemos por partes. CAS9 es el nombre de una endonucleasa utilizada por la bacteria para cortar el material genético viral. Es decir, es una enzima que actúa a modo de “tijeras moleculares” y, al cortar en dos el DNA viral, frena el ataque del virus. El tipo de CAS dependerá de la especie bacteriana, y en este caso, CAS9 corresponde a Escherichia coli.

CRISPR es un locus. Su nombre es un acrónimo de “clustered regularly interspaced short palindromic repeats”, lo que en español quiere decir “repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas”. Dentro de este locus, se encuentran unos espacios, llamados protoespaciadores, donde se integrarán los fragmentos del ADN viral previamente cortados por CRISPR. De este modo, la bacteria tendrá una serie de fragmentos que le servirán como guía frente a una segunda infección, a modo de biblioteca de “enemigos”.


Las secuencias repetidas del locus CRISPR. Tomado de: Karginov FV y Hannon GJ. Mol Cell 2010

Repeticiones palindrómicas separadas entre sí mediante unas secuencias denominadas “espaciadores” que se parecen a otras de virus y plásmidos. Justo delante de esas repeticiones y “espaciadores” hay una secuencia llamada “líder”. Estas secuencias son las que se llamaron CRISPR (Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente interespaciadas”). Muy cerca de este agrupamiento se podían encontrar unos genes que codificaban para un tipo de nucleasas: los genes cas.

¿Qué ocurre cuando se produce una segunda infección? Que el locus CRISPR se transcribirá en un pre-crRNA(también llamado ARN pre-CRISPR). Este pre-crRNA deberá madurar para unirse a CAS9, y en esta maduración interviene tracRNA (o transactivador), que se ha traducido previamente de una región no perteneciente a CRISPR.

Este transactivador se unirá a zonas conservadas, las palindrómicas repetidas (que no pertenecen a ningún fago) del pre-crRNA y se encargará: por un lado, de reclutar a la RNAasaIII (que producirá el corte en el pre-crRNA para que llegue a ser crRNA) y,a su vez, de reclutar a la CAS9.

Tras esto, cada crRNA se queda unido a un tracRNA y a una CAS9, formando un complejo.

Ahora, CAS9 está lista para atacar. Gracias al crRNA que le servirá como guía, podrá reconocer al DNA objetivo, o lo que es lo mismo, podrá reconocer a las secuencias del virus que causaron esa primera infección. Para que este reconocimiento se realice, es obligatoria la presencia de las secuencias PAM, propias del virus.Estas secuencias son un componente de orientación especial que forma parte del DNAviral y lo distingue del genoma bacteriano.

Una vez unido el complejo al DNA, la CAS9 abrirá las hebras justo por la diana y cortará. De este modo el DNA viral queda inhabilitado. ¿Lioso? Quizás este breve vídeo te ayude a comprenderlo mejor.

Cortesía de Devaki Bhaya, Michelle Davison y Rodolphe Barrangou, publicado originalmente en Annual Review of Genetics.

Ilustración dónde se reflejan las tres fases del mecanismo
de defensa de microorganismos llevado a cabo por CRISPR-Cas. 1-Proceso de adquisición dónde se identifica el material genético exógeno y se integra el protoespaciador en forma de espaciador. 2-Expresión de espaciadores primero en forma de precursor y, tras esto, en forma de crRNAs individuales. 3-Interferencia del material genético invasivo mediante la unión del crRNA que señaliza el corte llevado a cabo por proteínas Cas.

Pero, el sistema tiene sus fallos. Al parecer, los virus “trabajarían en equipo” para poder defenderse de este sistema inmune bacteriano. Cuando una bacteria bloquea un virus utilizando CRISPR, estos primeros virus son incapaces de afectar a la bacteria. Sin embargo, si el número de virus que infecta a una bacteria es muy elevado, estos tendrán tiempo para contraatacar: producirán “proteínas anti-CRISPR”, usando como base de su creación las “huellas” dejadas por el sistema bacteriano durante la eliminación de los primeros virus. La probabilidad de éxito de este sistema, es directamente proporcional al número de fagos que infecten a la misma bacteria. Tenéis toda la información en este artículo.

  • ¿Qué aplicaciones le podemos dar a CRISPR?

Como ya hemos dicho, podemos producir roturas es sitios específicos de nuestro DNA diana. El marco de posibilidades que nos ofrece este sistema es muy amplio y podrá verse implicado en áreas de estudio distintas, desde el campo sanitario hasta el campo agrícola.

Para empezar, debemos diseñar un RNAguía (gRNA), que consiste en una fusión del tracRNA y el crRNA, siendo este último el que porta el protoespaciador (secuencia complementaria a la secuencia diana). Todo ello se incluirá en un VectorCRISPR: el encargado de introducir toda la maquinaria en el interior de la célula. Además del gRNA, llevará un gen de nucleasa (Cas 9), un gen marcador/seleccionable y un promotor.



Fuente: Oxford genetics. Biology Engineered

Vector que contiene un casete para expresar Cas9 más un ARNg de elección.
Esta imagen muestra algunas de las secuencias y variantes de plásmidos más populares de la plataforma de plásmidos CRISPR. La colección de plásmidos incluye más de 2000 secuencias únicas de componentes funcionales (etiquetas peptídicas, genes informadores, genes de selección).
Componentes del sistema CRISPR-Cas9. Tomado de Daniel B. Graham y David E. Root. Genome Biology 2015

Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) forma un complejo con un ARN guía quimérico único (ARNgg) que comprende un espaciador que se hibrida con el sitio diana genómico, y un ARN de soporte denominado tracrRNA requerido para la formación del complejo. El protospacier motivo adyacente (PAM) se requiere para la especificidad de secuencia de la actividad de endonucleasa mediada por SpCas9 contra el ADN genómico.

Nos centraremos en el procedimiento de dos aplicaciones básicas:

  • EDICIÓN GENÓMICA:

Se puede diseñar un RNA guía que induzca cortes en el punto del genoma que queremos modificar y acompañar la introducción del sistema CRISPR/Cas con un fragmento de ADN homólogo a la zona de rotura (DNA donador) que lleve la modificación deseada a generar en el DNA diana.

Después de producirse la rotura por el sistema CRISPR/CAS, la célula va a repararla y en este caso utilizará la Recombinación Homóloga porque va a tener un fragmento homólogo para ello.

Fuente: Raul Piedra Castro. Médico de Familia.
Centro de Salud Azuqueca de Henares.

La HDR (Homology Directed Repair), disponiendo de un molde de reparación, es capaz de dar lugar a una edición precisa y rigurosa en el lugar de corte.

El resultado final es la reparación de la rotura con una modificación de la secuencia inicial. Obteniendo de este modo la introducción de secuencias nucleotídicas de interés en el genoma de una determinada célula u organismo.

  • OBTENCIÓN DE ORGANISMOS MUTANTES:

El procedimiento es similar al anterior salvo que la introducción del sistemaCRISPR/Cas no está acompañada por el DNA donador, por lo cual la reparación de la rotura se realizará por recombinación no homóloga y ello conllevará normalmente a la inserción o delección de bases. Esto implica la modificación del marco de lectura del gen volviéndolo no funcional.


Fuente: Raul Piedra Castro. Médico de Familia. Centro de Salud Azuqueca de Henares.

La NHEJ (Non-Homologous End-Joining) tendente a error puede resultar en mutaciones aleatorias y, por tanto, en cambios en la pauta de lectura generadores de codones de stop prematuros.

El resultado final será la posibilidad de estudio de la función de dicho gen (ante su ausencia se observanlos cambios y los efectos, de ahí que se acabe deduciendo su función). Así como la posibilidad de silenciar un determinador gen e impedir su transcripción.

Un caso reciente que nos muestra las sorprendentes posibilidades que nos ofrece CRISPR, es la noticia de un científico chino (HeJiankiu) que ha conseguido eliminar la posibilidad de infectarse del VIH en dos recién nacidas por medio de una modificación génica en la etapa embrionaria de éstas. Un vídeo nos puede dar una ligera idea de esto.

  • Pero, ¿es todo tan bueno como parece?

Según un estudio publicado recientemente en Nature Biotechnology, el sistema CRISPR puede provocar extensas mutaciones, aunque tan lejos del objetivo diana que no habrían sido detectadas con los métodos convencionales de genotipado. Esto se podría traducir como grandes cambios en una secuencia de nucleótidos que no nos interesaba modificar, con todo lo que ello supone. ¿Cómo afectaría este cambio a la descendencia? ¿Supera el beneficio al riesgo en todos los casos? ¿Cómo podríamos controlar este fenómeno? Este estudio podría ser una advertencia de las consecuencias de la modificación génica.

En definitiva, todo este asunto ha generado un inmenso debate. Un ejemplo claro puede verse en este hilo de Twitter, donde decenas de usuarios intercambian opiniones y plantean preguntas muy interesantes al respecto.

Basándonos en esto, decidimos hacer una pequeña encuesta vía Instagram dirigida a jóvenes de entre 18 y 25 años, con el objetivo de ver qué piensan las futuras generaciones sobre este tema.  Los resultados fueron los siguientes:

¿A favor de la modificación genética?  (67% Sí, 33% No) ¿Alimentos transgénicos? (63% Sí, 37% No)

Estas son probablemente las dos preguntas con mayor discrepancia, y solo puede traducirse de una manera: falta de información. Es nuestro deber, como científicos, trasladar nuestros conocimientos al resto de la población. El desconocimiento y miedo a las palabras “ciencia”, “química”, “tecnología” siguen siendo reales. Ciencia y sociedad no pueden transcurrir de forma paralela, sino que deben entenderse y apoyarse la una sobre la otra.

¿A favor de la modificación genética con fines estéticos? (13% Sí, 87% No)

La inmensa mayoría responde que no. Sin embargo, un 13% de los encuestados, responde que sí. ¿En qué se traduciría esto? ¿Qué ocurriría si esas personas estuvieran dispuestas a pagar por ello, como ocurre con las clínicas de medicina estética? Qué se implantaría, porque habría quien obtenga su beneficio. ¿Cuál es la idea que persiguen estas personas? ¿Acabaríamos todos siguiendo el mismo patrón estético? ¿El patrón que consideramos privilegiado?Podríamos pensar que es estúpido defender esta idea pensando en tener hijos con ojos azules, ¿pero lo es para los colectivos desfavorecidos? ¿Sería por ejemplo, una persona de raza negra, claramente discriminada socialmente, capaz de aceptar esta posibilidad con tal de que sus hijos no sufran la discriminación que ellos han vivido? ¿Sería esta una forma de acabar con la discriminación de colectivos oprimidos, ya que históricamente está demostrado que somos incapaces de aceptar nuestras diferencias físicas y que ellas determinan nuestra posición social?

¿A favor de la modificación genética para evitar el desarrollo de enfermedades como el SIDA? (93% Sí, 7% No) ¿Y cómo el Síndrome de Down? (91% Sí, 9% No) ¿Y para aumentar el coeficiente intelectual? (16% Sí, 84% No) ¿Y el arroz dorado? (90% Sí, 10% No)

Como podemos ver, aquí hay una tendencia aplastante en las respuestas, aunque con pequeñas excepciones. Si volvemos al anteriormente mencionado hilo de twitter, @AntonioGoBe tiene una respuesta muy interesante: integración social.

Según él, la mayoría de la sociedad estaría de acuerdo con la modificación genética, siempre que sea para beneficiar a aquellos individuos con desventajas, para que puedan estar al nivel del resto de la sociedad, y todos vivamos felices en armonía. Sin embargo, rechazaríamos aquellas modificaciones que supongan un beneficio de un individuo, o unos pocos, sobre el resto. ¿Es esto puro altruismo? ¿O es más bien un reflejo de la teoría del gen egoísta que nos describía Richard Dawkins?


  • Bilbliografía

Chira, S. Gulei, D.Hajitou, A. Andreea Zimta, A. Cordelier,P. Berindan-Neagoe, I ( junio de 2017). CRISPR/Cas9: Transcending the Reality of Genome Editing. Molecular Therapy Nucleic Acids, (7). P 211–222

Rath, D.Amlinger, L.Rath, A.Lundgren, M (octubre de 2015). The CRISPR-Cas immune system: Biology, mechanisms and applications. Biochime, (117) . P 119-118

Tian, P.Wang, J.Shen, X. Forrest Rey, J. Yuan,Q. Yan, Y ( septiembre de 2017). Fundamental CRISPR-Cas9 tools and current applications in microbial systems. Synthetic and Systems Biotechnology 2 (3). P 219-225

Kosicki, M. Tomberg, K y Bradley.A (julio de 2018). Repair of double-strand breaks induced by CRISPR–Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology (36).P 765–771

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