ANTIBIÓTICOS INHIBIDORES DE ADN Y ARN POLIMERASAS

Por Fátima Vioque Pastor y Maddi Vitoria Odriozola. 3º Biología Sanitaria. Universidad de Alcalá.

Hoy en día se están reduciendo las posibilidades de hacer frente a infecciones bacterianas de una forma efectiva, dado la gran cantidad de bacterias que han desarrollado resistencias frente a ellas. Los antibióticos convencionales, dirigidos a romper sus estructuras celulares o bloquearlas, están quedando obsoletos y se hace necesario buscar otras dianas para atacar a la célula infectante. (1,2)

Los actuales targets en desarrollo se basan en bloquear procesos fundamentales para la célula, siendo los más importantes la replicación y la transcripción.

ADN POLIMERASA

La enzima principal implicada en la replicación es la ADN polimerasa. Existen 5 polimerasas procariotas, destacando la ADN polimerasa III como responsable de la síntesis de la nueva hebra. Sin replicación, la célula no puede dividirse y muere. Por lo tanto, la actividad de la ADN polimerasa es esencial para la célula y bloquearla supone matarla. (1,2)

6-anilinouracilos

Los 6-anilinouracilos constituyen uno de los fármacos que inhiben la ADN polimerasa III de bacterias grampositivas. Cuentan con dos dominios que ejercen su acción inhibitoria. El primero de ellos es el dominio de emparejamiento de bases, compuesto por 3 componentes específicos de uracilo: anillo 1-NH, 2-ceto y componentes 6-NH. El segundo dominio, denominado dominio específico de enzima, es un grupo arilo modificado en N-6. 

Ambos dominios actúan de forma simultánea: el primer dominio forma puentes de hidrógeno con la citosina y el segundo dominio se une al único receptor de grupos arilos de la polimerasa. En consecuencia, el compuesto secuestra la enzima y no puede continuar la replicación, produciendo la muerte celular. (1)

Estructura de los 6-anilinouracilos (1)
Mecanismo de acción de los 6-anilinouracilos (1)

Experimentalmente y en comparación frente a otros antibióticos como rifampicina, gentamicina o ciprofloxacino; la ventaja que suponen es que las tasas de resistencia bacteriana a los 6-anilinouracilos son mucho menores, pero sigue habiendo resistencia. 

Para comprobar el mecanismo de resistencia, se aislaron las bacterias resistentes y analizaron la secuencia de la polimerasa, comprobando que el aminoácido de la posición 1264 estaba mutado. En la proteína original, se encontraría Phe, mientras que en la proteína mutada aparece Ser, Ile o Leu. Este aminoácido está situado en la región que inhibe el segundo dominio de los 6-anilinouracilos, por lo que se cree que no es reconocido y el antibiótico no puede ejercer su acción. (2)

Actividad antibacteriana de los NSAIDs

Un aspecto interesante se ha descubierto hace relativamente poco (2014), es la actividad antibacteriana de algunos antiinflamatorios no esteroideos (NSAIDs). 

Actúan inhibiendo la subunidad beta de la ADN pol III de E.coli. Esta subunidad también se conoce como sliding clamp (SC) y se encarga de reclutar diversas proteínas: las otras subunidades de la pol.III, DNA pol I, II, IV y V y MutS. Está formada por dos subsitios I y II, y en el subsitio I se localiza el CBM-binding pocket, que interacciona con el dominio CBM. 

El dominio CBM está presente y conservado en todos los factores nombrados. Por lo tanto, a la SC se le puede considerar una de las moléculas más transcurridas de la célula y en consecuencia, un posible target.

Se comprobó que los NSAIDs podían bloquear esta subunidad mediante cristalización por rayos X. En las imágenes podemos observar la superposición entre los distintos NSAIDs y la estructura del CBM-binding pocket. Los NSAIDs ocupan la subunidad I, bloqueando el CBM-binding pocket e inhibiendo la acción de la SC. 

Cristalización de rayos-X de los diferentes NSAIDs bloqueando el CBM-binding pocket (3)

Además, también se probó experimentalmente la actividad antibacteriana de los distintos NSAIDs in vitro frente a 4 especies: E. coli (-), Acinetobacter baylyi (-), Staphylococcus aureus (+) y Bacillus subtilis (+). Se fueron añadiendo concentraciones cada vez mayores de los fármacos y se observaba si había crecimiento. Pudieron comprobar que sí existía actividad antibacteriana, pero muy baja con respecto a un antibiótico propiamente dicho utilizado como control. (3)

ARN POLIMERASA

El segundo proceso más importante dentro de la célula es la transcripción. A este nivel pueden actuar la rifampicina y la estreptolidigina.

Rifampicina

La rifampicina es un análogo semisintético de la rifamicina. Tiene una mayor actividad contra las bacterias gram positivas, sobre todo contra las mycobacterias, además de una mayor efectividad contra las bacterias gram negativas junto con una gran biodisponibilidad oral. Se ha convertido en uno de los principales agentes usados en el tratamiento de la tuberculosis, lepra e infecciones de mycobacteria asociadas al SIDA. Sin embargo, se ha visto un rápido desarrollo de resistencias frente a la rifampicina, de modo que este antibiótico se usa generalmente combinado con otros agentes antimycobacterianos.

La actividad antibacteriana de la rifampicina se debe a la inhibición de la transcripción como consecuencia de una fuerte unión de la rifampicina a la RNA polimerasa de procariotas. La RNA polimerasa es una enzima compleja que consta de las siguientes subunidades: α2, β, β’ y σ. La unión de la rifampicina tiene lugar en la subunidad β.

El antibiótico interviene en la fase de iniciación de la transcripción. Una vez la síntesis avanza más allá de esta etapa temprana y la enzima transporta una cadena más larga de oligoribonucleótidos, el proceso deja de ser sensible a la rifampicina; es decir, la unión de la rifampicina al complejo formado por la RNA polimerasa y el DNA molde bloquea la elongación de la nueva cadena de RNA más allá de los primeros pasos. (4)

Estreptolidigina

El antibiótico estreptolidigina inhibe la iniciación, elongación y pirofosforolisis de las RNA polimerasas bacterianas. No inhibe las polimerasas eucariotas, ya que, aunque comparten gran parte de la estructura tridimensional con las polimerasas bacterianas, tienen pocas similitudes en la secuencia.

El hecho de que la estreptolidigina inhiba la iniciación, elongación y pirofosforolisis (la reacción inversa a la adición de nucleótidos) sugiere que el antibiótico tiene que inhibir una reacción que sea común en estos tres procesos, como, por ejemplo: la formación o ruptura del enlace fosfodiester o la translocación de la RNA polimerasa. (5)

Una parte esencial de la transcripción es la adición de nucleótidos a la nueva cadena de mRNA por acción de la RNA polimerasa y la estreptolidigina inhibe justamente el paso de inserción de NTP. (6)

Se ha encontrado un punto de unión de la estreptolidigina adyacente al puente hélice, distinto a los puntos de unión de los NTP. La estreptolidigina está en contacto con cuatro estructuras de la RNA polimerasa: β loops I y II, el puente hélice (BH) y el loop del canal secundario TL (trigger loop). (6) La comparación de las estructuras de la RNA polimerasa y el complejo RNA polimerasa-estreptolidigina revela que la unión del antibiótico provoca cambios conformacionales en el puente hélice (BH) y LT (trigger loop). (5)

Estructura de BH y LT en la RNA polimerasa (7)

El antibiótico estreptolidigina inhibe la RNA polimerasa bloqueando el centro activo en una conformación inactiva catalíticamente (7), lo cual interfiere en la formación de la conformación cíclica muy importante para la actividad de la RNA polimerasa. (5)

Mecanismo de acción de la estreptolidigina (6)

Se ha visto también que la unión de la estreptolidigina a la RNA polimerasa depende estrictamente de un ion Mg+2 no catalítico. (7)

BIBLIOGRAFÍA

  1. Tarantino, P. M., Zhi, C., Wright, G. E., & Brown, N. C. (1999). Inhibitors of DNA polymerase III as novel antimicrobial agents against gram-positive eubacteria. Antimicrobial agents and chemotherapy, 43(8), 1982-1987.
  2. Butler, M. M., Skow, D. J., Stephenson, R. O., Lyden, P. T., LaMarr, W. A., & Foster, K. A. (2002). Low frequencies of resistance among Staphylococcus and Enterococcus species to the bactericidal DNA polymerase inhibitor N3-hydroxybutyl 6-(3′-ethyl-4′-methylanilino) uracil. Antimicrobial agents and chemotherapy, 46(12), 3770-3775.
  3. Yin, Z., Wang, Y., Whittell, L. R., Jergic, S., Liu, M., Harry, E., … & Oakley, A. J. (2014). DNA replication is the target for the antibacterial effects of nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Chemistry & biology, 21(4), 481-487.
  4. Floss, H. G., & Yu, T. W. (2005). Rifamycin mode of action, resistance, and biosynthesis. Chemical reviews, 105(2), 621-632.
  5. Tuske, S., Sarafianos, S. G., Wang, X., Hudson, B., Sineva, E., Mukhopadhyay, J., … & Dharia, C. (2005). Inhibition of bacterial RNA polymerase by streptolydigin: stabilization of a straight-bridge-helix active-center conformation. Cell, 122(4), 541-552.
  6. Kyzer, S., Zhang, J., & Landick, R. (2005). Inhibition of RNA polymerase by streptolydigin: no cycling allowed. Cell, 122(4), 494-496.
  7. Zorov, S., Yuzenkova, Y., Nikiforov, V., Severinov, K., & Zenkin, N. (2014). Antibiotic streptolydigin requires noncatalytic mg2+ for binding to RNA Polymerase. Antimicrobial agents and chemotherapy, 58(3), 1420-1424.

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