Proteína Priónica Celular

Introducción y contexto histórico

Se utilizó por primera vez el concepto de prion para designar el agente causante de las encefalopatías espongiformes en mamíferos (TSE), que son una clase de enfermedades neurodegenerativas.

El prion Prp puede existir en dos conformaciones: PrpSc y Prpc. La PrpSc es la versión infecciosa que causa TSE, mientras que la PrPc es la versión normal de la proteina y no produce enfermedad.

En 1957 Carleton Gajduseky y Vincent Zigas, dos investigadores, comenzaron a estudiar el kuru, una enfermedad que afecta al sistema nervioso y que había sido descubierta en tribus de Nueva Guinea. Estas comunidades caníbales llevaban a cabo rituales donde llegaron a ingerir cerebros humanos, dato que llamó la atención de los investigadores. Con la ayuda del antropólogo R. Glasse pensaron que este podía ser un factor importante en la transmisión de la enfermedad, ya que encontraron numerosas semejanzas con otras infecciones neurológicas como es el caso del Scrapie (enfermedad del rascado en las ovejas) o la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. A pesar de esto, no llegaron a descubrir la causa de la enfermedad y se le atribuyó a un virus.
En los años sesenta, Alper y Griffith propusieron que el agente causante de esta infección podría ser una proteína carente de material genético, lo que causó un gran revuelo entre la comunidad científica de esos años.
Pero no fue hasta más de una década después hasta que Prusiner encontró una proteína extraña en los animales que estaba estudiando en el laboratorio que parecía ser la causante de la enfermedad y propuso el nombre de “Prión” para denominarla y distinguió las dos posibles estructuras que puede presentar: la PrPc, presente en células neuronales; y la PrPsc (llamada así debido a que se descubrió que era la causa de la enfermedad del Scrapie) , que es el agente infeccioso propiamente dicho.

El neurólogo norteamericano Stanley Prusiner, recibió el 7 de Octubre de 1997, el máximo galardón de investigación médica; el Premio Nobel de Medicina, el cual consideró como una reivindicación a su trabajo de más de veinte años frente al escepticismo con que fue recibido en un principio por la comunidad científica, puesto que sus descubrimientos y teorías contradecían el dogma central de la biología molecular.

Descripción de la estructura

El gen Prp codifica a PrPc, que posee alrededor de 250 aa según la especie.

La secuencia de aminoácidos de PrPc y de PrPpSc es la misma; es decir, ambas son la misma proteína pero con distinta conformación. Se las puede llamar confórmeros o isoformas. La diferencia entre ambas isoformas se encuentra en que la PrPc presenta un 40% de α-hélices y menos del 10% de láminas β en su estructura terciaria mientras que la PrpSc tiene alrededor de un 50% de láminas β, lo que la convierte en una proteína insoluble.

A la derecha se muestra la estructura de prpc, mientras que la imagen de la izquierda corresponde a prpsc. Se observa el mayor contenido de láminas β en prpsc, mientras que en prpc predominan las α-helices.
https://arxiv.org/ftp/arxiv/papers/1106/1106.3533.pdf
Imagen de la proteína PRPC
Secuencia de aminoácidos

La proteína PrPc consta de dos dominios: una porción N-terminal flexible, capaz de unir iones cobre y una porción C-terminal con un segmento hidrofóbico central altamente conservado que posee tres alfa hélices (denominadas H1, H2, H3).

El cambio conformacional principal que distingue a PrpSc de PrPc es la ausencia de alfa-hélice H1 de PrPc que está transformada en lamina beta en PrpSc, esto afecta a las propiedades físico-químicas de la proteína y a su funcionalidad:
-La PrpSc presenta escasa solubilidad en detergentes no iónicos, capacidad de formar agregados y resistencia parcial a la digestion con proteinasa k. La digestión de PrpSc con dicha enzima produce un fragmento truncado en el extremo N-terminal denominado Prp27-30 o Prpres (por resistente in vitro). Además, en condiciones fisiológicas está favorecida la conformación rica en α-hélice de PrPc siempre y cuando el gen PrP no este mutado. Muchas enfermedades causadas por priones se deben a mutaciones en el gen PrP que resultan en la síntesis de PrPc con conformaciones alteradas ricas en laminas β como la de PrpSc. Se trata de autenticas moléculas de PrpSc obtenidas en ausencia de infección por PrpSc exógena.

Papel bioquímico

Actualmente no existe una sola función de PrPc de la cual haya podido determinarse inequívocamente  que ocurre en las células in vivo salvo permitir la infección por parte de PrpSc.

Entre las funciones que se cree que posee la proteína PrPc descatacamos:

Posible papel en el metabolismo del cobre y defensa antioxidante.

La PrPc actúa como defensa frente a los radicales libres mediante su capacidad de secuestrar iones cobres libres del medio celular y mediante su asociación con superóxidodismutasas (SODs) que son enzimas que participan en la defensa antioxidante convirtiendo el radical libre anión superóxido en peróxido de hidrógeno, a las cuales la PrPrc les proporciona el cobre. Además, existe evidencia de que la propia PrPc tendría función enzimática de superóxido dismutasa.

El cobre parece ser importante para mantener la conformación de PrPc ya que estabiliza las α-hélices de la proteína al unirse a esta en forma cooperativa.

Según algunos autores, la PrPc podría funcionar como un receptor para la endocitosis de cobre mientras que para otros, la misma PrPc tendría dicha actividad de superóxido dismutasa y uniría iones cobre para emplearlos como cofactor.

Interacción con otras proteínas: supervivencia, diferenciación y transducción de señales.

Ciertas características estructurales de PrPc permitirían su interacción con otras proteínas. Entre los sitios potenciales para las interacciones se encuentra una de las α-hélices ubicada en el centro de la molécula y el ancla de GPI.

PrPc es capaz de unirse a heparinas y compuestos similares a esta. La heparina es un polianión sulfatado similar a los glicosaminoglicanos, que forman parte de la composición de las placas amiloides que se forman en presencia de PrpSc. Las moléculas de heparina secuestran PrPc impidiendo que se una a los glicosaminoglicanos por competencia.

La PrPc también se une a la proteína NCAM, una molécula de adhesión neuronal, al factor 2 relacionado a NF-E2, que es un factor de transcripción, a Bcl-2 y a la apolipoproteína E, proteína de membrana que esta involucrada en la enfermedad del Alzheimer. Además esto ocurre en los hoyos revestidos de clatrina de la membrana plasmática.

Otra proteína caracterizada como ligando de PrPc es el precursor del receptor de laminina de 37Kda. Se encontró que existe interacción de este receptor y PrPc tanto in vitro como in vivo y además está sobreexpresado en órganos que acumulan PrpSc. Actualmente se cree que éste es el receptor de PrpSc en las células de mamífero in vivo, aunque muy probablemente no sea el único.

La PrPc también  se une a la laminina, y el complejo laminina-PrPc favorece la neuritogénesis de células en cultivo tratadas con factor de crecimiento neuronal (NGF)(46), por esto se piensa que PrPc podría estar involucrada en el reconocimiento de ligandos y adhesión celular, mediante los cuales se disparan señales de proliferación y supervivencia en las células.

PrPc y transdución de señales.

A través de su localización en la membrana, PrPc podría participar en vías de transducción de señal.  Según algunos autores, la infección por priones afecta la función de canales de calcio.

Migración celular.

 La PrPc en celulas endoteliales que forman parte de la barrera hematoencefálica se acumula en las uniones célula-célula y participa de la transmigración de monocitos de los tejidos periféricos hacia el cerebro posiblemente mediante reconocimiento específico de ciertas moléculas de la superficie de los monocitos.

Evolución de esta proteína

Este prion está altamente conservado en la evolución y estaría presente en la mayoría de los vertebrados pero solo en mamíferos puede convertirse en patógeno y causar así la enfermedad. La semejanza entre las distintas PrPcs que se encuentran en mamíferos va desde el 85 al 97%, mientras que, al comparar la secuencia de la proteína entre mamíferos y humanos, la similitud varía entre el 92,9 y el 99,6%.

Hace varias décadas los priones se consideraban únicamente agentes causantes de enfermedades, pero en estos últimos años se ha cambiado esta opinión ya que se han encontrado numerosas evidencias de que pueden llegar a desempeñar numerosas funciones realmente importantes para las células (como la transducción de señales o el reconocimiento celular, al tratarse de una proteína de membrana).

Hay algunas teorías que aseguran que la PrPc tiene un origen vírico, estas afirman que el gen viral pudo pertenecer a un retrovirus que infectó a un vertebrado del cual evolucionaron el resto de ellos. De manera que el gen quedó incorporado en el genoma para siempre.
Pero, a pesar de esto, todavía no hay ningún estudio aceptado que muestre completamente cuál pudo ser el origen de esta proteína.

Implicaciones biomédicas y biotecnológicas

La mayoría de estudios en biomedicina han sido destinados a encontrar un método efectivo de detección de estas proteínas infectivas y diagnostico temprano de las enfermedades que producen. El diagnóstico de este tipo de enfermedades resulta dificultoso debido a que cada enfermedad presenta una serie de características y peculiaridades . Si a estas dificultades, le añadimos que no induce respuesta inmunitaria y que no podemos detectar anticuerpos en el suero, el diagnostico se convierte en una ardua tarea.  

La valoración de este tipo de enfermedades se realiza en función de la sintomatología, la historia clínica y determinadas pruebas médicas. Para llevar a cabo un diagnóstico definitivo se utilizan técnicas anatomopatológicas post-mortem, a partir de muestras cerebrales obtenidas a partir de biopsias o autopsias. Como apoyo para el diagnóstico de estas enfermedades se utilizan técnicas de imagen por resonancia magnética, así como el análisis del líquido cefalorraquídeo para revelar la presencia de proteínas, como por ejemplo las proteínas 14-3-3.

Los rasgos clásicos que se han observado se basan en el aspecto espongiforme (sobre todo en los ganglios basales), presencia de depósitos amiloides, astrocitosis y gliosis. 

El análisis de sangre es una técnica sencilla, pero que en este tipo de enfermedades no aportan información relevante, ya que no muestran modificaciones significativas, excepto un pequeño aumento de las transaminasas en un tercio de los casos. 

El análisis de líquido cefalorraquídeo convencional no aporta datos importantes. No obstante se emplean como marcadores las proteínas 14.3.3. La familia de estas proteínas está formada por varias isoformas. Se trata de proteínas omnipresentes, ya que se han hallado en todos los tejidos estudiados, y están, además, implicadas en procesos de división celular y de apoptosis. La utilización de este tipo de pruebas permite diferenciar enfermedades priónicas, como la CJD, frente a otras enfermedades. No obstante, no se trata de una prueba específica, ya que evidencia un estado de destrucción neuronal que puede darse también en otros procesos como ictus, encefalitis vírica, tumores cerebrales, etc…

Análisis del gen PRNP

Se lleva a cabo una secuenciación de la parte codificante del gen PRNP de manera que se puedan detectar tanto los polimorfismos como mutaciones. Este tipo de análisis puede ser aceptado en cualquier caso, incluso en aquellos que no presenten antecedentes familiares.

Estudio del tejido cerebral

Existen una serie de lesiones que se pueden observar en los tejidos nerviosos de pacientes que padecen enfermedades priónicas, como por ejemplo la deposición de amiloides . Se observan las neuronas mediante una tinción con rojo Congo, dando lugar a estructuras con formas de bastón/fibrillas

Resultado de imagen de agregados amiloides en neuronas
Representa tejido cerebral con agregados amiloides: https://www.google.com/search?biw=1707&bih=821&tbm=isch&sa=

Además de los métodos mencionado, también se pueden utilizar técnicas de inmunodiagnóstico, que se basan en métodos de innmunobloting y de ELISA. Se trata de técnicas basadas en el uso de anticuerpos, y la característica que presentan las isoformas patógenas de la proteína prion normal de ser resistentes a la digestión con proteasas. Son técnicas muy específicas, pero no lo suficientemente sensibles como para asegurarse de que se trata de un resultado negativo (en fases premortem).

Uno de los avances más importantes en el diagnóstico de las enfermedades ha sido el estudio de imagen por resonancia magnética. Se establece que la tomografía computarizada por emisión de fotones es más precisa que la espectroscopia por resonancia magnética de protones.

Resonancia magnética nuclear.

Por otro lado, los avances que se han producido en la biotecnología, han dado lugar al progreso de una serie de técnicas que nos permitirían el diagnóstico de este tipo de enfermedades, como por ejemplo la aplicación de la PMCA (amplificación cíclica de plegamiento incorrecto de proteínas) para detectar la infección por priones . Este tipo de tecnologías tiene la capacidad de detectar una única célula infectada con priones. Esta técnica se utiliza por ejemplo en estudios biotecnológicos de terapia celular (por ejemplo con línea celular derivada de la línea SK-MEL2). El proceso que se lleva a cabo para esta técnica es un proceso elaborado, los materiales celulares se tratan antes de llevar a cabo el procedimiento. Posteriormente se lleva a cabo una serie de incubaciones y ultracentrifugaciones con lavados de PBS. Las muestras se alicuotan y posteriormente, después de haber sido sometidas a enriquecimientos, se resuspendieron con el sustrato de PMCA correspondiente. Una vez que las muestras han sido tratadas se someten de nuevo a una incubación de 37º. Los productos serán digeridos después con proteínas durante una hora en un termociclador, y el proceso se finaliza con la transferencia a una membrana de nitrocelulosa.

PMCA. Observamos la dilución hasta la que se mantiene positiva la muestra.

Nuevos estudios

Equilibrio de la transmisión neuronal

Por otro lado nuevos estudios han determinado que la participación de la proteína priónica celular (PrPc) es fundamental para mantener el equilibrio en la transmisión neuronal en el sistema nervioso central. Este descubrimiento ha sido posible al comprobar, por primera vez, que tanto su ausencia como su exceso alteran notablemente este equilibrio. Sorprendentemente, en ambos casos, el umbral de excitabilidad del sistema nervioso central se altera llegando a niveles que pueden conducir a la generación de crisis epilépticas. Con este descubrimiento se dispone de más elementos para profundizar en el conocimiento básico de la epilepsia.

El estudio publicado en PLoS ONE también correlaciona la susceptibilidad diferencial inducida por la alteración de los niveles de PrPc con la expresión génica de los receptores de neurotransmisores excitadores e inhibidores en la corteza cerebral. La investigación realizada mediante transcriptónica con microarrays permitió identificar un conjunto de 129 genes corregulados en la ausencia y sobreexpresión de la proteína en el cerebro de los animales de experimentación. El estudio de las vías canónicas asociadas a estos genes corregulados y su posterior validación permitió determinar por primera vez que tanto la ausencia como la sobreexpresión de la PrPc afecta a los niveles de expresión de receptores de glutamato (AMPA-kainato) –neurotransmisor excitador- y del GABA (GABAA)–neurotransmisor inhibidor-. Por último, los efectos de la regulación diferencial fueron corroborados con técnicas electrofisiológicas.

Detección con nanopartículas de oro

Es un sistema, basado en una estructura cristalina de nanopartículas de oro, es un proyecto de investigación cuyos resultados acaba de publicar la revista Proceedings of the National Academy os Sciences (PNAS) en un artículo en el que se destaca el diseño de un supercristal capaz de actuar como una nanoantena que identifica la ‘huella dactilar’ de una molécula.

El sensor detecta hasta un total de diez priones por cada litro de sangre El método consiste en sumergir el supercristal con un sensor óptico en una muestra de plasma o sangre centrifugada. Luego el sensor genera un campo eléctrico extremadamente alto en la superficie de cristal, “y esto hace que obtengamos la señal que rebota en los priones de forma ampliada y, de este modo, es fácil cuantificar su presencia”

Interacción de priones con colesterol

Un nuevo estudio publicado en la revista online y de acceso libre BMC Biology sugiere que las alteraciones en el colesterol de la membrana podrían ser el mecanismo por el que los priones originan la neurodegeneración, y apuntaría al papel del colesterol en otras enfermedades neurodegenerativas.

Bibliografía

  1. Artículo: “Las proteínas infecciosas o priones. Un nuevo mecanismo de enfermedad” por Luis Benítez-Bribiescas: Unidad de Investigación Médica en Enferrnedades Oncológicas. Hospital deOncologia, Centro MBdico Nacional Siglo XXI. Coordinador: Fabio Salamanca-Gómez. Disponible en : http://www.anmm.org.mx/bgmm/1864_2007/1998-134-1-107-109.pdf
  2. Artículo “Priones encefalopatías espongiformes transmisibles: un recorrido por su historia” por Pena, Irene (2011). Disponible en: http://sedici.unlp.edu.ar/bitstream/handle/10915/11272/Documento_completo.pdf? sequence=1
  3. Artículo “Biology of Prions” por Verónica Inés Cacace, Instituto de investigaciones cardiologicas, Universidad de Buenos Aires-Conicet, Buenos Aires, Argentina. Junio, 2011. Disponible en: https://arxiv.org/ftp/arxiv/papers/1106/1106.3533.pdf
  4. Artículo “Enfermedades producidas por priones” por Torres, JM. Brun, A. Castilla, J. y Sánchez, JM. (2012) disponible en: http://www.veterinaria.org/revistas/vetenfinf/bse/priones/priones.htm
  5. Artículo “Biology of Prions” por Cacace, Veronica (2011) disponible en: https://pdfs.semanticscholar.org/e4fb/a3cc5bf1ff152caf28dd0ef0776faa4b757e.pdf
  6. Artículo “Encefalopatías espongiformes transmisibles; bases molecular, diagnóstico y perspectivas terapéuticas.” por Vargas AM, Salto R., Sola MM., Hortelano P. (2001) Disponible en: http://digibug.ugr.es/bitstream/handle/10481/28254/Ars%20Pharm.2001%3b42%2812%295-20.pdf?sequence=1&isAllowed=y
  7. Portal web: Neurowikia (2019) “enfermedades priónicas” disponible en: http://www.neurowikia.es/content/enfermedades-pri%C3%B3nicas
  8. Adam Lyon, Charles E., Frank Borriello, Gelnn C. Telling, Claudio Soto, Sandra Pritzkow. (2019) Titulo: “Aplicación de PMCA para detectar la infección por priones en una línea celular humana utilizada para producir terapias biologías”.

Trabajo realizado por: Lorena Martín, Alicia Martín e Itziar Martínez. 1C Biología Sanitaria.

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