Terapia génica sobre p53

Javier López Casado, Mario López Prieto y Jesús Rosales Magallares. Biología sanitaria – Universidad de Alcalá Henares

La terapia génica implica el uso terapéutico de genes para tratar enfermedades como cáncer o enfermedades genéticas hereditarias. La mayor dificultad es encontrar un método efectivo para el delivery a un target especifico. 

La terapia de reemplazo de p53 es una estrategia antitumoral para inducir la expresión del gen de p53 y consecuentemente lograr la muerte de células tumorales que presenten p53 inactivada o mutada. Como ya sabemos, p53 actúa como supresor tumoral a través de distintos procesos celulares como la senescencia, autofagia, apoptosis y arresto del ciclo celular. Los estudios indican que se encuentra inactivada en más del 50% de los tipos de cáncer en humanos. Para inducir la expresión de un gen de p53 exógeno se pueden emplear cuatro sistemas de transferencia: liposomas catiónicos, adenovirus sin capacidad replicativa, adenovirus con capacidad replicativa, CRISPR/Cas9 y transducción proteica.

Comparado con vectores virales, los no virales son más seguros y tienen características farmacológicas superiores, como la baja inmunogenicidad y baja toxicidad, pero tienen menores eficacia de transfección y target a tumor in vivo.

Terapia génica sobre p53 mediada por liposomas

Los liposomas son estructuras esféricas compuestas de un centro/núcleo hidrofílico rodeado de una o varias bicapas de lípidos anfifílicos (fosfolípidos). A nivel terapéutico, se emplean liposomas catiónicos (pueden albergar miRNA, siRNA o DNA entre otros) como sistemas de “delivery” para transfectar células cancerosas humanas con genes p53 exógeno en experimentos in vitro. Sin embargo, su baja estabilidad y rápida descomposición en el interior celular hace que deban ser modificados para aumentar su eficacia. Por ejemplo se puede añadir polietilenglicol, un polímero hidrofílico que confiere estabilización estérica a la superficie del liposoma al formar una capa protectora sobre esta, y así disminuir el reconocimiento por opsoninas y la consecuente eliminación de los liposomas.

Por otro lado, se necesita que los liposomas se dirijan exclusivamente a las células cancerosas, para lo que se usa un targeting activo, bien usando inmunoliposomas (liposomas conjugados con anticuerpos específicos), bien usando ligandos como la proteína EGF en el caso de cáncer de ovario.

EGF, al encontrarse unido a la superficie del liposoma, permite la endocitosis del complejo liposoma-EGF por parte de las células tumorales, de tal manera que aumenta la tasa de transfección y facilita la penetración del gen p53 exógeno al interior celular, donde llevará a cabo su acción antitumoral.

Frente a los liposomas, los cuales presentan desventajas como la falta de métodos asequibles económicamente para su preparación, su baja capacidad de carga y su baja estabilidad y rápida degradación en el interior celular, en la actualidad se está aumentando el empleo de nanopartículas lipídicas, ya que se ha observado no solo una mayor biocompatibilidad, sino también una menor toxicidad y liberación controlada y sostenida del DNA.

Sistema de terapia génica usando liposomas. EGF permite la entrada específica en células de cáncer de ovario. A nivel intracelular, parte de los liposomas-EGF serán degradados en lisosomas, mientras que también es posible el «escape» del gen de p53, que se dirigirá al núcleo para ser transcrito y posteriormente traducido para dar lugar a la proteína p53 funcional. Created with BioRender.com

Terapia génica sobre p53 mediada por adenovirus

Los Ad-p53 son vectores de adenovirus que portan el gen salvaje (no mutado) de p53, los principales medicamentos que utilizan esta técnica son Gendicine, Advexin y SCH-58500 los cuales ya han sido utilizados en ensayos clínicos para distintos tipos de cáncer. (Foto: Gendicine)

Para restaurar la función de p53 en tumores con esta desactivada, se ha desarrollado esta estrategia mediada por adenovirus. Además de la acción directa, esta terapia consta con mecanismos de acción indirecta como inhibición de la angiogénesis (vascularización tumoral) e inicia la respuesta inmune antitumoral al aumentar la expresión local de la proteína CD95L que da como lugar a una infiltración masiva de neutrófilos e inhibición del crecimiento tumoral.

La imagen representa el modo de acción de Ad-p53. Al expresar el gen correcto para p53 que porta, suplirá la p53 inactiva de la célula cancerosa (Representado por la flecha roja de inhibición) e inducirá la muerte celular. Created with BioRender.com

El adenovirus recombinante es el vector viral más usado en terapia génica, esto se debe a sus muchas ventajas como: alta eficiencia en la transferencia de genes, capacidad de transporte para genes largos, distribución selectiva de genes, leve citotoxicidad, fácil manipulación y construcción y un precio de manufactura accesible.

Respecto a su seguridad en pacientes, el Ad-p53 ha sido modificado para que no se replique y no cause infección, aun así, tiene como efecto secundario fiebre transitoria durante pocas horas, característica del uso de vectores virales. La forma de introducirlo es mínimamente invasiva, se realiza mediante inyección que puede ser: intratumoral, intraperitoneal y intravesical.

Estos Ad-p53 se traducen tanto en células sanas como cancerígenas e inducen una expresión por encima de la fisiológica como comentaba previamente, a estos niveles de traducción las células normales no son afectadas, lo que indica baja toxicidad, sin embargo, la cantidad de p53 es citotóxica para las células tumorales.

La terapia puede realizarse de dos formas: monoterapia, usando únicamente el Ad-p53 o combinado con quimioterapia y radioterapia, donde ya se ha demostrado una mayor tasa de respuesta que usando simplemente las formas tradicionales de terapia oncológica.

Sin embargo, la activación de p53 por Ad-p53 suele ser insuficiente para inducir la expresión de p53 a niveles muy profundos lo que lo hace inviable en cánceres avanzados, por ello se han desarrollado nuevos adenovirus oncolíticos capaces de replicarse selectivamente y que además expresan p53 para mejorar estos resultados, son los denominados CRAd-p53.

Estos CRAd-53 surgen al combinar dos terapias que antes de usaban por separado, el Ad-p53 y los virus oncoliticos, por ello esta terapia además de la vía de muerte celular mediada por p53 característica de los Ad-p53, tiene un gran poder antitumoral por la vía de E1A, un factor estimulador de la replicación viral. Estas dos vías, además, de la capacidad de replicarse e infectar otras células tumorales, los hace más efectivos y capaces frente a cánceres avanzados. Estos vectores aún se encuentran en estudios preclínicos y algunos ejemplos son: AdDelta24-p53, SG600-p53 y OBP-702.

La imagen representa el modo de acción de CRAd-p53. Vemos que infecta a células normales y cancerosas pero solo se replica selectivamente en las últimas, también vemos el efecto combinado de la expresión de p53 y la replicación viral. Created with BioRender.com

Este E1A está bajo la regulación de un promotor tumoral específico lo que le permite esa selectividad, debido a las modificaciones que impiden su replicación, el Ad-p53 no posee este gen (E1A deficiente). Esta vía comienza con la activación de la trascripción del factor E2F1 por E1A, este E2F1 a su vez estimula dos miRNAs (miR-93 y miR-106b) que suprimen la expresión de p21. La supresión de p21 a su vez estimula a p53 estimulando la apoptosis y autofagia en estas células. Esto hace que en vez de arrestarse el ciclo se produzca la muerte celular.

Vias para la muerte celular en OBP-702, un tipo de CRAd-p53. Podemos ver tanto la vía de muerte celular mediada por p53 como la mediada por E1A al inhibir p21. Obtenido de: doi: 10.1517/14712598.2013.845662.

Terapia génica sobre p53 mediada por transducción proteica

Cuando se emplean adenovirus como vectores en la terapia de reemplazo de p53, algunas células tumorales CAR-negativas pueden sobrevivir, y por tanto se puede emplear la transducción proteica para tratar estos casos, entre otros. Por otro lado, la transducción proteica, al igual que el empleo de liposomas, tiene un menor riesgo de generar toxicidad que el sistema mediado por adenovirus.

Péptidos de poliarginina como PTD

La transducción proteica es un método que permite a proteínas, péptidos y otros compuestos biológicamente activos penetrar en la membrana plasmática al fusionarlos con dominios de transducción de proteínas (PTDs) o péptidos de penetración celular (CPPs).

Uno de estos PTDs es la 11-poliarginina (11R), la cual, si se fusiona con la proteína p53 (11R-p53), es capaz de penetrar la membrana plasmática de células tumorales y translocar al núcleo. Una vez en el núcleo, será p53 la que permita inducir la actividad del gen WAF1/CIP1, que al transcribirse da la proteína p21, encargada de arrestar el ciclo celular y así lograr la inhibición de la proliferación de células de cáncer en los que p53 había mutado.

Por otra parte el tratamiento con cisplatino, fármaco que induce apoptosis en células tumorales, después de la transducción de 11R-P53 aumentaba la eficacia en la apoptosis de las células comparado con el tratamiento solamente con cisplatino.

Por tanto, el efecto de 11R-p53 se puede considerar similar a los mecanismos mediados por adenovirus, pero presenta ventajas y desventajas:

Ventajas: más seguro y menor toxicidad frente al empleo de adenovirus como vectores. 11R-p53 no induce apoptosis/inhibición crecimiento en astrocitos primarios, al contrario que estos.

Desventajas: el empleo de 11R-p53 tiene un efecto más débil que el de adenovirus, y por tanto se requiere una administración repetitiva de 11R-p53 a altas concentraciones para que sea eficaz.

Mecanismo de acción de 11R-p53 en células tumorales con p53 mutada. La mayor parte queda retenida en macropinosomas, donde será degradado; mientras que una pequeña proporción llega al núcleo, donde una parte será degradada por el sistema de ubiquitinación y otra parte aumenta la actividad del gen WAF1/CIP1, lo cual lleva al arresto del ciclo celular. Created with BioRender.com

Empleo del extremo N-terminal de la subunidad HA2 de influenzavirus

Como se ha indicado, la desventaja principal en el uso de 11R-p53 como antitumoral radica en la necesidad de administrar altas dosis de forma repetida en el tiempo para lograr un efecto similar al conseguido en el empleo de adenovirus.

Esto se debe principalmente a que 11R-p53 queda retenida en el interior de macropinosomas en el citoplasma de las células tumorales, donde sufre una rápida degradación. Para solventarlo, es posible fusionar 11R-p53 con el dominio N-terminal de la subunidad HA2 del influenzavirus (20 aminoácidos), el cual es un péptido fusogénico dependiente de pH que induce la lisis de membrana a niveles bajos (ácidos) de pH. De esta manera, la presencia de ese péptido de 20 aminoácidos facilita la liberación o escape de 11R-p53-HA2 de los macropinosomas, y por tanto se aumenta la eficacia del método y se aumenta la actividad transcripcional y en definitiva, su efecto antitumoral.

Esto se demostró empleando 9R-p53-HA2 (se ha observado que el uso 9R permite aumentar en mayor medida la actividad transcripcional que si se emplea 11R) para tratar células de glioma.

Además, 9R-p53-HA2 se transloca de forma más eficaz al núcleo que 11R-p53, ya que no queda retenido en los macropinosomas citoplasmáticos y como consecuencia, se necesita una menor concentración para inducir la apoptosis que al usar 11R-p53.

Sin embargo, este sistema tiene una desventaja con respecto al empleo de 11R-p53, y es que 9R-p53-HA2 se degrada más rápido que 11R-p53. Esto se debe a que, al dirigirse al núcleo celular de forma más eficaz, sufre una mayor degradación por el sistema de ubiquitinación que regula de forma endógena a p53.

Mecanismo de acción de 9R-p53-HA2 en células tumorales con p53 mutada. HA2 permite una mayor escape de los macropinosomas, por lo que una mayor cantidad de proteína llega al núcleo. Al llegar una mayor cantidad al núcleo, mayor será su degradación el sistema de ubiquitinación y también mayor será su efecto sobre WAF1/CIP1, por lo que aumenta la eficacia del arresto del ciclo celular. Created with BioRender.com

Empleo del péptido C-terminal de p53

Como se acaba de explicar, la mayor desventaja en emplear un sistema de escape de los macropinosomas (péptido N-terminal de la subunidad HA2 del influenzavirus) radica en la mayor degradación que sufre por el sistema de ubiquitinación a nivel nuclear. Para solventar esta desventaja, es posible diseñar proteínas p53 resistentes a ese sistema de ubiquitinación para así aumentar su actividad y eficacia como antitumoral.

La modificación del péptido C-terminal de p53 provoca que sea resistente a la proteólisis mediada por ubiquitinación, lo cual permite aumentar la eficacia de este sistema de transducción proteica.

Esto se demostró en células de líneas celulares de cáncer de vejiga (J82 y T24), en las que se lograba la inhibición del crecimiento tanto in vitro como in vivo. El péptido que se construye tiene los siguientes componentes:

  • Isómero D del extremo C-terminal de p53 (p53C´). Permite resistir la proteólisis mediada por ubiquitinación a nivel nuclear, aumentando la actividad transcripcional y el efecto antitumoral.
  • Péptido retroinverso de la subunidad HA2 de influenzavirus (riHA2). Permite que el péptido “escape” de los macropinosomas y se dirija al núcleo.
  • CPP, bien 11R, bien el CPP derivado del virus Flock House (FHV). Permite la penetración en las células tumorales.

A modo de resumen, el empleo del péptido d11R-p53C´-riHA2 o dFHV-p53C´-riHA2 mejorar la inhibición del crecimiento de células tumorales de glioma, aumentar la tasa de apoptosis de estas e incrementar la supervivencia a largo plazo de ratones con metástasis peritoneal de cáncer de vejiga; y en definitiva, permite mejorar el efecto antitumoral tanto in vitro como in vivo.

Mecanismo de acción de 11R-p53C`-HA2 en células tumorales con p53 mutada. HA2 permite una mayor escape de los macropinosomas, por lo que una mayor cantidad de proteína llega al núcleo. Como el extremo C-terminal de p53 ha sido modificado para ser resistente a la degradación proteolítica, no es degradado a nivel nuclear y tiene un mayor efecto sobre WAF1/CIP1 y por tanto se aumenta enormemente la eficacia del arresto del ciclo celular. Created with BioRender.com

Otro ejemplo del empleo de poliarginina para la transducción proteica

Otro ejemplo de la efectividad de la transducción proteica, en este caso sobre células de líneas celulares de leucemia con p53 mutada (K562, Jurkat y HL-60), consiste de nuevo, en la creación de un péptido quimérico basado en p53 y que está formado por los siguientes componentes:

  • P53: flanqueada en su extremo C-terminal por un CPP y en su extremo N-terminal por M3.
  • 12-poliarginina (12R): es un CPP que permite, al igual que los ya citados 11R y 9R, la penetración en células tumorales.
  • M3: es el dominio de activación transcripcional del extremo N-terminal (aminoácidos 1-62) de myoD. El factor myoD es un factor de transcripción que al unirse a otros factores de transcripción (en este caso p53), aumenta la capacidad transcripcional de estos, y por tanto aumenta la actividad transcripcional de p53.
Esquema de la proteína quimérica empleada. Created with BioRender.com

Los dos péptidos citados unidos a p53 (M3-p53-12R), permiten crear una proteína p53 activa y dominante que penetre en las células objetivo y una vez en ellas, inhibe su proliferación y activa apoptosis de manera específica, por lo que se puede usar para tratar tumores hematológicos o metastásicos por su inyección intravenosa. Todavía se desconoce si M3 actúa revirtiendo el rol recesivo que presenta la proteína p53 salvaje endógena o si bien las altas dosis de M3-p53-12R son las que se superponen al efecto de la p53 mutada endógena.

M3-p53-12R es capaz de inducir arresto del ciclo celular y apoptosis en las tres líneas de células tumorales de leucemia sin tener efectos apoptóticos en células madre mesenquimales. Esto implica que, a pesar de carecer de un sistema de “escape” de los macropinosomas, la suficiente cantidad de proteína quimérica es capaz de penetrar en el núcleo celular de las células cancerígenas, donde llevará a cabo su acción antitumoral y donde será rápidamente degradada por el sistema de ubiquitinación de p53. Por tanto, y derivado de estos dos inconvenientes (ausencia de sistema de escape de macropinosomas y rápida degradación a nivel nuclear), serán necesarias dosis repetidas y diarias para suprimir la proliferación de células de leucemia en tratamientos a largo plazo.

Terapia génica sobre P53 mediada por el sistema CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 es un sistema de defensa de origen bacteriano. Un gRNA guía a la nucleasa Cas9 hasta una secuencia determinada para producir un corte de doble cadena. El uso de este sistema abre las puertas para el desarrollo de la edición genética y la búsqueda de nuevos tratamientos.

Un tratamiento revolucionario que se está investigando, consiste en la edición genética del gen p53 mutado, eliminándolo por completo mediante el uso de CRISPR/Cas9 en células tumorales, y posteriormente sustituirlo por una copia funcional de cDNA con el gen P53wt por recombinación homóloga, para producir la proteína normal y que se dé la regresión del tumor.

Otras técnicas que introducen una copia del gen P53wt en las células tumorales tienen el inconveniente de que la p53 mutada puede interferir con el tratamiento haciendo que la p53 se tetramerice antes de llegar al núcleo y le impide actuar frente a sus targets. El uso de CRISPR/Cas9 soluciona este problema eliminando p53 mutada antes de introducir la P53wt.

Se ha mejorado el sistema de CRISPR/Cas9 mediante el uso de una variante mutada de Cas9, Cas9-HF a la que además se le une en su extremo N-terminal la Cyclin Destruction Box (CDB), para reducir la vida media de Cas9-HF  mediante ubiquitinación, disminuyendo el tiempo de exposición del genoma a la actividad nucleasa de Cas9-HF.  La expresión de esta nucleasa quimérica, se ve impulsada por la presencia de survivina, una proteína que inhibe la apoptosis y es altamente expresada en células tumorales, de esta manera se restringe la actividad nucleasa solo a las células tumorales.

Son necesarios dos RNA guías (gRNA) para llevar a cabo el proceso. Se introduce una secuencia entre los dos RNA guías, la cual es reconocida por una endoribonucleasa eucariota, Rcl1, que produce un corte en el transcrito para liberar los RNA guías activos.

Con estos RNA guías diseñados para dirigirse al locus p53 y con la Cas9-HF que produce un corte de doble cadena en ambos extremos, se crea un sistema CRISPR/Cas9 muy específico.

El sistema utiliza un vector híbrido de un bacteriófago filamentoso M13 y adenovirus (vectores AAVP) que contiene 4 casetes de expresión. Es específico para tumores y es inducible, facilitando así la monitorización de su funcionalidad y el efecto terapéutico. El vector es encapsulado en nanopartículas del fago que se dirige a células tumorales gracias a la unión del ligando RGD4C a la cápside que interacciona con los receptores de integrinas αvβ3 y αvβ5 específicos de tumores. Aun no se ha conseguido crear un sistema que diferencie distintos tipos celulares de cáncer, pero si una célula normal de una célula tumoral.

El vector contiene dos RNA guias y su promotor U6, la secuencia de Cas9HF-CDB y su promotor Survivina. El gen de resistencia a la neomicina como marcador, el gen p53wt, su promotor TRE3G, el gen Tet-ON3G con su promotor Survivina y a ambos lados las secuencias homólogas al genoma tumoral. Tet-ON3G es un sistema transcripcional que se usa para controlar la expresión del gen en vectores, y solo se activa en presencia de tetraciclina o doxiciclina.

La imagen muestra el vector utilizado en esta terapia de edición genética. Se aprecia los gRNA, la Cas9HF-CDB y la P53wt. Created with BioRender.com

La survivina de las células tumorales activa la expresión de Tet-on3G, pero se expresa de forma inactiva, al añadir doxiciclina posteriormente, se activa la proteína y se une al promotor TRE3G para que se produzca la expresión de p53, por lo tanto es un sistema controlado por la inducción de doxiciclina.

Este vector se puede producir con un bajo coste y en unos tres días, pudiendo generar este nuevo sistema un impacto social y económico.

El sistema se sigue investigando para aumentar la especificidad y eficiencia del tratamiento, aunque diversos estudios indican que una terapia adyuvante va a ser necesaria para conseguir una regresión significante del tumor.

Otro tratamiento distinto en estudio que también combina la p53 y CRISPR/Cas9 consiste en construir un sensor genético que detecta la expresión de la proteína p53wt y se combina con la toxina diftérica para matar específicamente a células que no presenten la p53wt, como las células tumorales.

EL proceso consiste en la cotransfección de dos vectores. El primero contiene una secuencia para el reconocimiento y la unión de p53wt, p53BER. El promotor SV40, la secuencia de la Cas9,  gRNA para la toxina diftérica con ribozimas a ambos lados para producir un autocorte y liberar el gRNA. Tras el autocorte de las ribozimas el RNAm de la Cas9 perdería la cola de poli A y para protegerlo es necesario el uso de una triple hélice. El segundo vector contiene el promotor HEf1A y el gen de la toxina diftérica.

El sensor genético funciona de distinta manera en células tumorales que, en células normales, dependiendo de la presencia o no de p53wt.  En células normales, la p53wt se une a p53BER, se activa el promotor SV40 y se libera el gRNA y la Cas9, formando el sistema CRISPR/Cas9 que va a actuar sobre el gen de la toxina diftérica para inhibir su síntesis. Pero si la célula es tumoral, la proteína p53wt no está presente, por lo tanto, no se va a activar la expresión de Cas9 ni se va a liberar el gRNA. El sistema CRISPR/Cas9 no va a poder inhibir la expresión de la toxina diftérica, produciéndose así la muerte celular. En resumen, cuando esta presente P53wt, se expresa el sistema CRISPR/Cas9 y protege a la célula del daño que pueda causar la toxina diftérica, atacando así solo a células tumorales.

La imagen muestra la acción del sensor genético en una célula normal. En presencia de p53wt, el sensor expresa el sistema CRISPR/Cas9 y se impide la expresión de la toxina diftérica. Created with BioRender.com
La imagen muestra la acción del sensor genético en una célula tumoral. En ausencia de p53wt, el sensor no expresa el sistema CRISPR/Cas9 por lo tanto no se inhibe a la toxina diftérica y se produce la muerte celular. Created with BioRender.com

Los vectores pueden introducirse mediante el uso de virus oncolíticos, nanopartículas lipídicas y fagos. Además, si el estudio continúa, se podrían utilizar otras toxinas diferentes a la diftérica y determinar si los valores fisiológicos de p53wt en distintos tipos de células normales son suficientes para activar el sensor genético.

El uso del sistema CRISPR/Cas9 dirigido hacia la p53 nos proporciona un nuevo enfoque de estudio para diseñar revolucionarios tratamientos frente al cáncer.

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