Caspasas: armas de autodestrucción celular

INTRODUCCIÓN

Las caspasas son una familia de enzimas caracterizadas por su actividad proteolítica, empleando un residuo de cisteína de su centro catalítico, cisteín-proteasas, cortando por un residuo de aspartato. De su actividad: cysteine-dependent aspartate-directed protease, proviene su nombre, caspasa, (caspase en inglés). Curiosamente, este nombre nos puede recordar a la famosa «caspa» de la cabeza, donde podemos encontrar dicha proteína ya que son células epiteliales que han sufrido apoptosis, la función principal de la proteína de la que vamos a tratar a continuación. Su peso molecular oscila entre los 32 y 55 KDa, y son sintetizados como zimógenos formando tetrámeros.

Como ya hemos comentado, las caspasas están muy implicadas en el proceso de apoptosis o muerte celular programada. Es el grupo de proteínas principal ya que se activa para iniciar y ejecutar este proceso, y regula al resto de factores apoptóticos de la célula. La apoptosis (del griego “caída de las hojas de árboles en otoño”, término acuñado por Kerr, Wyllie y Currie en 1972) es el proceso por el que una célula regula su propia muerte cuando recibe las señales propias para esta. Se diferencia de la necrosis en que esta se debe a daños traumáticos en la célula que hacen que esta muera pasivamente.

Las caspasas son las proteínas principales debido a su gran capacidad proteolítica, degradación de proteínas, lo que permite cortar el contacto con células vecinas, reorganizar el citoesqueleto, activar endonucleasas, desmantelar las láminas nucleares, expresar señales de fagocitosis (fosfatidilserina) y activar proteínas específicas para preparar a la célula para el cese de actividades metabólicas.

Las caspasas se dividen en tres grupos: un grupo inflamatorio (caspasas 1, 4, 5 y 13), que interviene en la producción de citocinas(maduración de algunas interleucinas), un grupo activador (caspasas 2, 8, 9 y 10) y por último, un grupo efector (caspasas 3, 6 y 7).

Debido a su papel relevante en la apoptosis, y no alargar demasiado este trabajo, vamos a centrarnos en el grupo activador y efector. También se han visto en procesos de diferenciación celular, teniendo un papel muy destacable en la diferenciación de células musculares, o mieloides, monocitos y eritrocitos.

ESTRUCTURA

Las caspasas son homólogas entre sí , compartiendo similitudes en secuencia de aminoácidos , estructura y especificidad de sustratos. Contienen tres dominios: un prodominio N-terminal, una subunidad larga (p20) que contiene el centro activo con cisteína dentro de un motivo conservado QACXG, y una subunidad pequeña (p10) en el C-terminal. Las caspasas son unas de las proteasas más específicas con un requerimiento inusual y absoluto de cortar después de un residuo de ácido aspártico (Asp) (Stennicke, 1998). El prodominio y la subunidad larga están separados por un lugar de corte con aspártico, y la subunidad grande está separada de la pequeña por uno o dos motivos de corte en Asp. La presencia de Asp en los motivos de corte para la maduración es consistente con la habilidad de las caspasas de autoactivarse o de ser activadas por otras caspasas como parte de una cascada de amplificación.

Las caspasas son sintetizadas como zimógenos enzimáticamente inertes que deben ser cortados proteolíticamente para ser activos. La enzima madura es un heterotetrámero que contiene dos p20/p10 heterodímeros y dos centros activos al que contribuyen las dos subunidades con residuos necesarios para la unión al sustrato y la catálisis.

Las caspasas activadoras poseen un prodominio largo, ausente en las efectoras, que contiene un módulo de interacción proteína-proteína que permite la unión y asociación con sus reguladores. Las caspasas -8 y -10 contienen un dominio efector de muerte (death-effector domain, DED ) mientras que las caspasas -2 y -9 contienen un dominio de reclutamiento y activación de caspasas (caspase activation and recruitment domain, CARD ). Estos dos dominios tienen secuencias distintas, pero se pliegan en una disposición espacial similar que consiste en seis hélices-α antiparalelas (Hofmann K, 1999). Este plegamiento también se encuentra en el dominio de muerte (death domain, DD ), una tercera proteína de interacción presente en varios reguladores iniciales de la apoptosis como CD95 y la molécula adaptadora FADD. Parece que DD, DED y CARD derivan de un dominio ancestral común. 

La formación de la enzima es un tetradímero formado por las subunidades grande y pequeñas, que tiene dos centros activos. El centro catalítico está formado por los bucles L1-L4. Los bucles L1 y L3 están muy conservados, mientras que los dominios L2 y L3 son responsables de la diferentes especificidad de los sustratos.

Vamos a realizar un estudio más exhausto de una de las caspasas mejor conocidas: la caspasa-9. Su estructura consiste en una cadena-A (amarilla), y una cadena-B (rojo) . Las dos cadenas polipeptídicas se asocian formando un heterodímero, que se compacta en una única estructura de un único dominio de unas dimensiones de aproximadamente 26 Å X 37 Å X 39 Å, y de una superficie accesible al solvente de ~11918 Å2 .

Imagen que contiene texto, mapa

Descripción generada automáticamente
Chou, KC., Tomasselli, AG., Heinrikson, RL. (2000).  Prediction of the tertiary structure of a caspase-9/inhibitor complex  [Estructura]. Recuperado de febs.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1016/S0014-5793%2800%2901333-8. Ac-DVAS-fmk es un inhibidor de la caspasa

Las dos subunidades interactúan extensamente unidas entre ellas por 28 puentes de hidrógeno, teniendo como superficie accesible al solvente de unos  3590 Å2 . Como era de esperar, la topología es similar a la de la caspasa-1, caspasa-3 y caspasa-8, con un típico  motivo de plegamiento α/β .

El núcleo de la enzima está compuesto por unas 6 cadenas de lámina β central, de la cual, cuatro hebras ( β1, β2, β3, β4) son donadas por la cadena-A, y dos ( β5, β6) por la cadena-B. Excepto la  β6, las primeras 5 hebras son todas paralelas.

De acuerdo con la disposición de las láminas- β observadas en proteínas, la lámina- β en la estructura predicha de la caspasa-9 asume un giro a la derecha, como resultado de la optimización energética.

Las láminas-β están rodeada por 5 α-hélices: dos (α2, α3) están localizadas en un lado de la lámina, y 3 (α1, α4, α5), en el otro. Las hélices de α1, α2 y α3 pertenecen a la cadena-A, y las α4 y α5 a la cadena-B.

El lazo entre β3 y α3 contiene láminas-β minoritarias formadas por dos hebras-β cortas antiparalelas, y el lazo entre α5 y β6 contiene una α-hélice muy corta, α13.

Como pasa con los otros componentes de la familia caspasa, el C-terminal de la cadena-A y el N-terminal de la cadena-B, se encuentran en finales opuestos de la molécula, y parecen participar en la formación de heterotetrámeros de proteasas.

Imagenes obtenidas del Protein Data Bank 1JXQ
Structure of cleaved, CARD domain deleted Caspase-9, DOI: 10.2210/pdb1JXQ/pdb , y modificadas posteriormente con Chimera

Estructura de la caspasa by diegoypablo on Sketchfab

PAPEL BIOQUÍMICO

Para que la célula inicie su propia muerte debe de dejar de recibir estímulos de supervivencia de las células vecinas, tales como hormonas y factores de crecimiento. Las señales que la llevan a apoptosis son principalmente elevados niveles de oxidantes en la célula, daños en el DNA, radiaciones ionizantes o luz ultravioleta o fármacos quimioterapéuticos. Los procesos que se dan durante la apoptosis son estrechamiento rápido del citosol, pérdida de contacto con las células vecinas mediante la alteración de los mecanismos de adhesión entre estas, compactación del material genético mediante desoxirribonucleasas, condensación del citoplasma y formación de vesículas, cuerpos apoptóticos, con restos de núcleo, orgánulos y proteínas resistentes a la proteólisis que serán fagocitados. El papel específico de las funciones en la apoptosis ya ha sido mencionado en la introducción.

Las caspasas son sintetizadas como un precursor inactivo, procaspasa, que se activa al ser cortada por un punto de corte de ácido aspártico que separa el prodominio de p20 y uno o dos separan p20 de p10.

El grupo iniciador (caspasas 2, 8, 9 y 10): se activan por autoproteólisis (dimerización), al recibir estímulos apoptóticos, mediante adaptadores/activadores o al ser translocadas a compartimentos específicos (apoptosoma). La caspasa 9 necesita además un cambio conformacional. Por otro lado tenemos el grupo efector o ejecutor (caspasas 3, 6 y 7): se activan por cortes específicos mediante las caspasas iniciadoras. Emplean un residuo de cisteína en su sitio activo como nucleófilo catalítico para escindir sustratos proteicos con residuos de ácido aspártico en sus estructuras. Estas pueden ser activadas en lo que conocemos como caspase cascade (cascada de la caspasa), por la cual las caspasa se activan siendo expuestas a otra previamente activada, y sirve para amplificar las señales proapoptóticas.

Existen dos vías para la activación de la caspasa, y por tanto, inicio de la apoptosis: la vía intrínseca y la vía extrínseca. La vía intrínseca tiene a la mitocondria como protagonista. Esta contiene en su espacio intermembrana proteínas apoptóticas que son liberadas cuando detecta situación de estrés en el medio. Los miembros de la familia Bcl-2 regulan la permeabilidad de la membrana mediante las acciones opuestas entre estos, ya que tenemos proteínas apoptóticas y antiapoptóticas. Por un lado, la activación de proteínas Bax y Bak (posiblemente mediada por p53 y activadas por la proteína Bid) pueden asociarse con el complejo del poro y originar su apertura. Por otro lado, proteínas como Noxa y Puma, se encargan de inactivar a las anteriores. Entre las proteínas que son liberadas se encuentra el citocromo c, la Smac/DIABLO o AIF. El citocromo c se une en el citoplasma a la proteína Apaf-1, que al ser oligomerizada, se juntan a la procaspasa 9 formando el apoptosoma que activa la caspasa 9 y da lugar a la caspase cascade. La proteína Smac/DIABLO inhibe la actividad los IAPs (Inhibidor de Proteínas Apoptóticas), y el AIF (Factor Inductor de la Apoptosis) estimula la apoptosis a nivel nuclear (degradación DNA), independientementede la actividad de las caspasas.

Vía intrínseca de activación de caspasas

Imagen obtenida de KEGG Pathway (map 04210) y dividida en tres partes

La vía extrínseca se basa en la unión de un ligando (activador) con un receptor transmembrana, denominados receptores de muerte. Los receptores mejor conocidos son TNFR1 y Fas. El receptor TNFR1 se une al ligando TNF (Factor de Necrosis Tumoral), y se ha encontrado en en células T activadas por macrófagos en respuesta a infección. El receptor Fas se une al ligando FasL, que es presentado por células T citotóxicas que inducen la apoptosis en células infectadas uniendo su ligando al receptor Fas. Entonces, se envía una señal al citoplasma que activa las caspasas inciadoras, como la caspasa 8, da lugar a la caspase cascade y activa a las ejecutoras por proteólisis, las caspasas 3 y 7, y también esta puede activar la vía intrínseca de la apoptosis ya que activa la proteína Bid que puede promover la salida del citocromo c de la mitocondria. Todo ello está regulado por factores proteicos como el IAP (inhibidor de proteínas apoptóticas).

Vía extrínseca de activación de caspasas

La degradación oligonucleosómica del DNA tiene lugar gracias a una DNasa, la CAD, que es activada por la caspasa 3. La CAD se encuentra en el citoplasma formando un complejo inactivo con la proteína ICAD, la cual favorece el correcto plegamiento de CAD e inhibe su actividad, hasta que, si se da el caso, la caspasa 3 rompe la unión y la CAD se introduce en el núcleo para realizar su actividad. Además, las caspasas en el núcleo ejercen efecto en la poli(ADP-ribosa) polimerasa o PARP para que pierda capacidad de reparar DNA, inactivan la topoisomerasa II, y la caspasa 6 degrada las láminas nucleares.

Imagen de http://gmot.uib.es/moleculas/caspasas/caspasas.html

Algunas consecuencias de la activación de caspasas

EVOLUCIÓN DE LAS CASPASAS

La caspasa fue el primer miembro identificado de una gran familia de proteasas cuyos miembros tienen diversas funciones en inflamación y apoptosis. Las caspasas están altamente conservadas en la evolución y pueden ser encontradas desde humanos, pasando por insectos y nematodos hasta la Hidra (Budihardjo I, Cikala M, Earnshaw WC, 1999).

Debido a un estudio filogenético, la familia génica de las caspasas está compuesta por dos grandes subfamilias relacionadas con ICE (grupo inflamatorio), o con su homólogo en mamíferos, de ced-3 (grupo apoptótico), dentro de esta, se sitúan 14 miembros en mamíferos, de los cuales 11 se encuentran en humanos formando enzimas. La primera caspasa fue identificada como ejecutora de la apoptosis en el nematodo Caenorhabditis elegans. Hasta la fecha, se han identificado diversas caspasas en varias especies de vertebrados e invertebrados. En humanos Homo Sapiens, 11 caspasas, incluyendo caspasa-1 hasta la caspasa-10, y la caspasa-14.Otros tipos de caspasas como la -11,-12 y -13 se han visto en otros mamíferos como roedores y en vacas Bos taurus. Recientemente se han identificado las caspasas -15,-16 ,-17 y-18 como nuevos miembros de la familia de las caspasas en vertebrados, aunque todavía se desconoce su función (Eckhart et al., 2005; Sakata et al., 2007; Eckhart et al., 2008;).

También en peces se han encontrado caspasas específicas de estos: caspy, caspy2 y el dominio de reclutamiento de caspasas (CARD) casp-8 (Masumoto et al., 2003; Sakamaki et al., 2007;). Las caspasas se han encontrado en otros tipos de animales, como la esponja Geodia cydonium, Hydra vulgaris, la anémona Aiptasia pallida, nematodo Caenorhabditis elegans, la mosca de la fruta Drosophila melanogaster, erizo de mar Strongylocentrotus purpuratus, y los ascidiáceos  Ciona intestinalis and Ciona savignyi (Shaham, 1998; Cikala et al., 1999; Lamkanfi et al., 2002; Terajima et al., 2003; Wiens et al., 2003; Weill et al., 2005; Dunn et al., 2006; Robertson et al., 2006; Kumar, 2007;).

Las caspasas comprenden una parte esencial en la apoptosis, función que ha conservado a lo largo de la evolución, pero el número de caspasas viene definido por el tipo de especie, siendo distinto entre estas. Esto indica que las funciones específicas de la especie o la diversificación de los roles fisiológicos de cada especie se han cultivado a través de la evolución de la caspasa.

PAPEL BIOTECNOLÓGICO Y BIOMÉDICO

La apoptosis es un mecanismo esencial en el mantenimiento de la homeostasis celular. Regula tanto el desarrollo como la etapa adulta de los seres  vivos, ya que se encarga de deshacer estructuras de todos los niveles del cuerpo que ya no son necesarias, como la cola de los renacuajos,  las membranas entre los dedos del embrión ratón, las neuronas que no han establecido una correcta sinapsis en los primeros años de vida, células con ADN dañado (precancerosas) o células que ya no son necesarias para el sistema inmunitario y de mantener el tamaño adecuado de las estructuras del organismo; esto se da gracias a que se regula con la división celular, por ejemplo, en las células del hígado de ratones está comprobado que son capaces de mantener el tamaño natural en caso de defecto o exceso por mitosis o apoptosis respectivamente.

Sin embargo, se ha visto que muchas enfermedades están relacionadas con procesos anormales de apoptosis, bien por inhibición de esta o por exceso.  Los casos en los que hay un aumento de la supervivencia celular, y por tanto una inhibición de apoptosis, serían algunos tipo de cáncer, colorrectal, glioma, linfoma folicular y carcinomas con mutaciones de p53, tumores dependientes de hormonas, cáncer de mama, próstata y ovario, enfermedades autoinmunes, lupus eritematoso sistémico, miastenia gravis, e infecciones virales, herpesvirus, poxvirus, adenovirus. Por el lado contrario, enfermedades relacionadas con un exceso de muerte celular, y por tanto de apoptosis, son enfermedades neurodegenerativas, Alzheimer, Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, rinitis pigmentos, epilepsia, enfermedades del sistema hematopoyético, anemia aplásica, linfocitopenia T CD4+, daño a órganos, diabetes mellitus tipo 1, pancreatitis alcohólica, daño isquémico (miocardio, retina, cerebro, riñón) y SIDA.

En el caso de enfermedades con exceso de muerte celular, habría que tratar de encontrar el punto común donde poder bloquear los dos mecanismos de esta. Existen ciertos fármacos inhibidores de caspasas, como el BAF, z-VAD-FMK, pero hay muy pocos modelos in vivo, y su tasa de inhibición es muy pobre. También debemos pensar que si una célula está destinada a morir, quizás puede resultar más dañino tratar de conservarla a que muera para el tejido.

Sin embargo, en el lado contrario tenemos enfermedades que inhiben la apoptosis ya mencionadas. Se está investigando qué fármacos usar para activar la vía mitocondrial como diana terapéutica en la que inducir la muerte celular y destruir células malignas. Se emplearía dicha vía ya que la mitocondria responde eficazmente al ambiente (ante agentes quimioterapéuticos o toxinas celulares) modificando su membrana, ya sea estabilizándola con proteínas de la familia Bcl-2, o como se pretende para el cáncer, distorsionándola, con calcio, ROS y BAX, para que libere factores apoptóticos como los ya mencionados citocromo c, o Smac/DIABLO, y activen la cascada de las caspasas.

La caspasa-3 es un efector clave en el proceso de la apoptosis, amplificando la señal del activador de caspasas (como la caspasa-8) y con una importante función en la descomposición celular. El reactivo CellEvent Caspase-3/7 Green Detection , comprende el péptido DEVD de 4 aminoácidos  -que contiene lugares de reconocimiento para caspasas 3 y 7- conjugados a un colorante de unión a ácidos nucleicos. Debido a que el péptico DEVD inhibe la capacidad del colorante para unirse al ADN, si no hay caspasa 3/7 activada, el reactivo de detección no será fluorescente. Sin embargo, en presencia de caspasa 3/7 activada, el colorante se escinde del péptico DEVD y se libera para unirse al ADN, produciendo una señal fluorescente verde brillante que indica apoptosis. Esto nos ayudaría a marcar las células que están en proceso de apoptosis, una técnica que puede resultar muy útil en cualquier estudio de enfermedades relacionadas con dicho proceso, como el cáncer o Alzheimer.

CONCLUSIÓN

Tras haber realizado este trabajo, podemos afirmar con rotundidad que la caspasa tiene un papel primordial en el proceso de la apoptosis, y por tanto, en la homeostasis de tejidos. Pero aún falta mucho por comprender de este grupo de proteínas. Por ejemplo, cuál fue la proteína precursora que dio lugar a estas cisteín-proteasas, y por qué esa especificidad por cortar proteínas por el residuo aspartato. Y por supuesto, cómo ha ido evolucionando su relación con el resto de proteínas que también intervienen en la apoptosis. También, si sabemos que aparece en el nematodo C. elegans, debió de aparecer pronto en la evolución animal, pero desconocemos exactamente en qué punto, cuál fue la primera célula capaz y dispuesta a sacrificarse por el bien común del conjunto de las demás. Si se siguen investigando estas y otras preguntas para conocer esta enzima tan importante, seremos capaces de dar con aplicaciones biomédicas concretas para el diagnóstico y/o tratamiento de muchas enfermedades en las que se encuentra implicada, como muchos tipos de cáncer, Alzheimer o SIDA.

BIBLIOGRAFÍA

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https://www.lifeder.com/caspasa/

Trabajo realizado por Diego de León Oliva y Pablo Ignacio Miniggio Mejías

1º Biología Sanitaria, Universidad de Alcalá