LACTATO DESHIDROGENASA

Por Sandra Peñas López, Félix Daniel Trueba Vega y Helena Pérez López

Grado en Biología Sanitaria UAH

1. INTRODUCCIÓN

La LDH es un enzima oxidorreductasa que cataliza la reacción piruvato ↔ lactato en presencia de NADH+H/ NAD+, oxidándose el lactato a piruvato y reduciéndose el piruvato a lactato. Esta enzima se encuentra ampliamente distribuida en tejidos animales, vegetales y en microorganismos, especialmente en hígado y músculo esquelético y cardíaco. 

Resultado de imagen para reaccion lactato deshidrogenasa

Existen tres  tipos principales de LDH:  LDH-A, LDH-B y LDH-C.

La LDH  tiene un peso molecular de  aproximadamente 140 kDa. Presenta la estructura de un tetrámero, formado por subunidades unidas por enlaces hidrófobos, puentes de hidrógeno y fuerzas electrostáticas. Existen dos tipos distintos de subunidades: M (muscle) y H (heart), que dan lugar a cinco tipos de isoenzimas o isoformas distintas (H4, M1H3, M2H2, M3H1 y M4).

Las isoformas son enzimas que tienen la misma estructura y catalizan la misma reacción pero la secuencia de aminoácidos es distinta.

La LDH es una enzima citoplasmática. Sin embargo, se ha observado cierta afinidad de la subunidad M para unirse a las membranas, que depende de la proporción NADH/NAD+. Su centro activo se encuentra en el interior de cada subunidad, siendo específico para L-lactato, y utiliza NAD+ como coenzima. La unión de la coenzima provoca un cambio de conformación diferente según su estado de oxidación, lo que permite el acceso del sustrato. 

Tiene un importante papel en el diagnóstico de patologías cardíacas y hepáticas, ya que allí es especialmente abundante.

2. ESTRUCTURA DEL ENZIMA

2.a. Isoenzimas

Origen

Los seres humanos poseen dos genes que codifican dos subunidades cuya función es la de aportar estructura a la LDH; estos genes son el gen LDH-A y el gen LDH-B.

El gen LDH-A está situado en el cromosoma 11, en la zona 11p15.1 del cromosoma, y codifica las cadenas polipeptídicas A o M de la LDH, a las cuales les asignaremos el color morado.

Cromosoma 11 de Homo Sapiens

En cambio, el gen LDH-B está situado en el cromosoma 12, en la zona 12p12.1, y codifica a las cadenas polipeptídicas B o H de la LDH, a las cuales asignaremos el color amarillo.

Cromosoma 12 de Homo Sapiens

Secuencia

Aunque los dos polipéptidos son muy similares estructuralmente y casi no se aprecia a la vista sus diferencias, su secuencia nos puede revelar más diferencias.

Podemos observar las diferencias entre las secuencias fijándonos en los colores: en color negro están los aminoácidos iguales, en ocre los similares y en blanco los diferentes.

Estos pequeños cambios en la secuencia de aminoácidos modifican un poco las propiedades fisicoquímicas de cada isoenzima, cambiando, por ejemplo, su punto isoeléctrico y sus propiedades cinéticas.

Estructura

La LDH es un tetrámero (4 subunidades), y se pueden formar 5 isoenzimas distintas.

 M4 : Se suele encontrar en mayor proporción en el corazón, los músculos y los eritrocitos.

 M3H :  mayor proporción en el sistema retículo endotelial y en leucocitos.

M2H2 : Hay mayor proporción en los pulmones.

 MH3 : Se suele encontrar en mayor proporción en los riñones, la placenta y el páncreas.

H4 : Se suele encontrar en mayor proporción en el hígado y el músculo esquelético.

Cantidad presente

Dependiendo de cómo se expresen los genes LDH-A y LDH-B tendremos mayor cantidad de un polipéptido o de otro en cada tejido o célula. Por ejemplo, en el hígado hay mayor cantidad de isoenzima M4 y un poco de M3H; en el músculo cardíaco, en cambio, hay mayor cantidad de isoenzima H4 y un poco de MH3, y en los leucocitos cuya isoenzima mayoritaria es la M2H2 ,  hay cantidad similar de M3H respecto a MHy de M4 respecto a H4.

(hígado: http://biomodel.uah.es/lab/acetato/LDH_genes.htm)

(músculo cardiaco: http://biomodel.uah.es/lab/acetato/LDH_genes.htm)

(leucocitos: http://biomodel.uah.es/lab/acetato/LDH_genes.htm)

Estructura 3D

PROTEINA LDH de Homo Sapiens by felixD2000 on Sketchfab

La LDH consta de 4 subunidades las cuales vienen dadas por las cinco isoenzimas anteriormente nombradas que se pueden formar.

La estructura de la LDH es un 44% helicoidal presentando 15 estructuras alfa-hélice y 148 residuos, mientras presente un 18% de estructuras lámina beta con 15 láminas y 63 residuos.

Su estructura tetramérica tiene un peso molecular promedio de unos 140 kDa y el sitio de unión para el NADH o en NAD+ consta de una lámina β-plegada compuesta por seis cadenas y 4 hélices alfa.

Estructura H vs M

HUMAN HEART L-LACTATE DEHYDROGENASE H CHAIN, by felixD2000 on Sketchfab

HUMAN MUSCLE L-LACTATE DEHYDROGENASE M CHAIN by felixD2000 on Sketchfab

Como se observa, la estructura de la LDH con predominancia de isoenzima H (propia del corazón) está compuesta por un total de 2 cadenas con una longitud de 333 residuos; la primera cadena tiene una longitud de 160 residuos y la segunda de 173 residuos. A su vez, es un 45% de estructura helicoidal con 16 hélices alfa y 150 residuos y un 17% de estructura beta laminar, con 15 láminas y 57 residuos.

En cambio, la estructura con predominancia de isoenzima M (propia de la musculatura) tiene un total de 8 cadenas con una longitud de 331 residuos; el primer domino tiene una longitud de 159 residuos y el segundo una longitud de 172 residuos. A su vez, es un 45% helicoidal con 16 hélices alfa y 159 residuos, y un 18% beta laminar (con 16 láminas y 61 residuos).

3. PAPEL BIOQUÍMICO

La LDH es un enzima especialmente abundante en el músculo esquelético y el corazón.

En  músculo esquelético abunda la isoforma 4M, donde cataliza la reacción pirúvico → láctico mediante reducción del NADH+ a NAD+. Este NAD+ se utiliza en la glucólisis para transformar el gliceraldehído 3 fosfato en piruvato y así generar energía que será usada por el músculo.

En el corazón predomina la isoforma 4H, donde se ve favorecida la reacción láctico → pirúvico mediante la oxidación del NAD+, formándose NADH++H+. Este NADH+ se incorpora a las mitocondrias para generar energía en forma de ATP.

Interviene en el metabolismo de los glúcidos, en la fermentación láctica que es un proceso de oxidación de glucosa que se produce en condiciones anaeróbicas (en ausencia de O2) en el citoplasma celular. El ácido pirúvico es reducido a ácido láctico mediante la acción de la láctico deshidrogensa (LDH). Estos H+ provienen de la molécula de NADH+H+ que se oxida a NAD+

Resultado de imagen para reaccion lactato deshidrogenasa

Con lo cual, al realizar la respiración anaerobia nuestras células sólo obtendrían 2 ATP de energía procedentes de la glucólisis ya que el poder reductor (NADH, H+) se consume para que tenga lugar la reacción. 

En el primer paso de la neoglucogénesis a partir de lactato:

Cuando los niveles de G son bajos en sangre, los hepatocitos transforman el glucógeno en G6P. La enzima glucofosfatasa elimina el grupo P y da lugar a G que libera a sangre.

Las células musculares pueden degradar el glucógeno en G6P pero carecen de la enzima glucofosfatasa, por lo que no pueden dar lugar a glucosas. La G6P sigue la ruta de glucólisis y se transforma en piruvato y este en lactato (porque no se requiere E). Como el lactato acidifica a la célula, este sale a sangre siendo transportado hasta el hígado. Allí, un enzima lo transformará en piruvato que por la vía de la glucólisis inversa se transforma en G6P y esta se transforma en G liberada a sangre.

Imagen relacionada

4. EVOLUCIÓN

La LDH es una de las proteínas más utilizadas en el estudio de las isozimas y de su evolución molecular. Todos los vertebrados, excepto la lamprea atlántica, tienen al menos dos LDH, la LDH-A y la LDH-B, ambas surgidas por la duplicación de un gen en torno al origen de los vertebrados; en algunos casos existe la isoenzima LDH-C, para cuyo origen hay dos hipótesis: algunos estudios apoyan la idea de que evolucionó a partir del gen LDH-A, aunque otros afirman que representa la divergencia más temprana dentro de la familia de genes LDH y que es la isoenzima más primitiva.

Se han propuesto dos modelos clásicos para explicar la evolución molecular de las isoenzimas LDH de vertebrados. La primera hipótesis sugiere que tuvieron lugar varias duplicaciones de genes independientes a lo largo de la evolución del gen LDH primitivo para dar lugar a los presentes loci. La segunda hipótesis sugiere que todos estos loci específicos de tejido  derivan de una sola duplicación del gen LDH en la evolución temprana de los vertebrados. 

La primera duplicación en genes LDH de vertebrados probablemente se remonta a hace 500 M.a, durante la temprana evolución de los agnatos. Sin embargo, dos isoenzimas LDH se han distinguido electroforéticamente en un mixín (agnato), y por tanto la duplicación de genes puede haber ocurrido incluso antes, en procordados como el anfioxo (cefalocordado) o tunicados, puesto que los esfuerzos de clonación recientes han permitido encontrar  un único gen LDH en un nemátodo y un tunicado y dos genes LDH en Drosophila Melanogaster (invertebrado).

Análisis filogenéticos recientes sugieren que el proceso de evolución molecular está gobernado principalmente por pequeñas duplicaciones de ADN independientes (regionales) en vertebrados . En conclusión, se refuerza la  hipótesis de que la evolución del gen LDH está dictada por duplicaciones de genes independientes que ocurren en diferentes clases de vertebrados.

No obstante, aún es demasiado pronto para afirmar de manera concluyente que la duplicación del gen LDH de vertebrados ocurrió en vertebrados sin mandíbula (agnatos). El trabajo futuro es clave  para entender el origen de la complejidad genómica de la LDH por duplicación de genes, por lo que la datación correcta de la divergencia entre las isoenzimas de la LDH en invertebrados y en vertebrados debe esperar hasta que todo haya sido estudiado  de manera adecuada y se pueda afirmar alguna hipótesis concluyentemente.

Otro punto a resaltar es que las variaciones en los aminoácidos de la LDH-A son mínimas, mientras que los cambios en la LDH-B son más notables y abundantes, lo que puede llevar a que las diferencias entre las diversas isoenzimas de la LDH en los distintos seres vivos sean más pequeñas de lo esperado.

4.a. Árbol filogenético

Imagen 1: comparación entre las diferentes isoformas de la LDH a lo largo de la escala zoológica.

Imagen 2: diferencia entre los nucleótidos de cinco especies animales diferentes

5. INTERÉS BIOMÉDICO/BIOTECNOLÓGICO

La determinación  de la actividad lactato deshidrogenasa (LDH) tiene una gran variedad de aplicaciones clínicas. Se trata de un enzima intracelular, por lo que, ante un cualquier daño tisular pasa a sangre, siendo su elevación un signo inespecífico de lesión. También es un índice de proliferación en el seguimiento de una neoplasia y es relativamente valiosa para el diagnóstico y seguimiento del infarto agudo de miocardio pues su elevación en este proceso es poco específica. 

El valor normal de la concentración sanguínea de LDH es: 105 – 333 UI/l (unidades internacionales por litro). Estos valores pueden variar ligeramente entre laboratorios. En cambio, la concentración plasmática es: 190 – 390 UI/l.

5.a. Exploración funcional del hígado

Entre las funciones del hígado destaca la detoxificación y metabolismo del alcohol. La oxidación del etanol a acetaldehído es realizada por la ADH, obteniéndose también NADH+H+.

El aumento de NADH+H+ provoca:

·         Aumento de láctico debido a que al aumentar el NADH, la LDH lo usa para formar ácido láctico, obteniendo también NAD+. El láctico acidifica al hepatocito, por lo que sale a sangre y provoca acidosis metabólica.

·         Disminuye el oxalacético (por ↓NAD+). Esto provoca:

–        Disminución de neoglucogénesis por vía de la glucólisis inversa.

–        Al ↓glucosa, se produce hipoglucemia.

·         No se sintetiza 3GlP (por ↓NAD+). Por tanto:

–        Se bloquea parte de la glucólisis.

–        Aumenta Gl3P, que sirve para la síntesis de glicerina, por lo que aumenta la lipogénesis. Aparece un hígado graso.

5.b. Infarto agudo de miocardio

La muerte celular provoca la liberación de su contenido a sangre, incluyendo enzimas como LDH. Niveles altos en sangre de este enzima, concretamente de la isoforma 4H, podrán utilizarse para el diagnóstico del infarto agudo de miocardio y otras cardiopatías.

Comienza a elevarse 12-24 horas después de producido el infarto; alcanza un pico entre las 48-72 horas y permanece elevada desde el séptimo al décimo día.

5.c. Marcador tumoral

Los marcadores tumorales son sustancias que pueden aparecen en cantidades mayores que las normales en la sangre, orina, o tejidos del cuerpo de algunos pacientes con ciertos tipos de cáncer u otras enfermedades.

La deshidrogenasa láctica (LDH) es una proteína que se encuentra en todo el cuerpo, y es, a su vez, uno de los marcadores tumorales medidos con mayor frecuencia. Casi todo tipo de cáncer, así como muchas otras enfermedades, pueden causar un nivel elevado de LDH, por tanto, no puede ser utilizado para el diagnóstico de un cáncer específico. 

El análisis de LDH puede utilizarse también para supervisar el tratamiento de algunos cánceres como el cáncer de testículo, el sarcoma de Ewing, el linfoma no-Hodgkin y algunos tipos de leucemia. Unos niveles elevados de LDH pueden ser causados por trastornos no cancerosos entre los que se incluyen insuficiencia cardíaca, hipotiroidismo, anemia y enfermedades del pulmón y el hígado.

5.d. Detección de las distintas isoformas de LDH

Las distintas isoenzimas presentan características cinéticas y fisicoquímicas diferentes. Se han numerado del 1 al 5 en función de su movilidad electroforética. Así la LDH-1 (H4) es la que más avanza hacia el ánodo mientras que la LDH-5 (M4) es la de menor movilidad electroforética. 

Imagen 3: práctica de laboratorio de nuestro grupo

Se pueden usar diversas técnicas, como el inmunoensayo, densitometría o técnicas espectrofotométricas (como en la práctica).

Para determinar la presencia de las distintas isoformas se realiza una electroforesis, ya que cada una tiene un punto isoeléctrico distinto. Después de la separación electroforética, las diferentes isoenzimas de la LDH se pueden revelar por una coloración específica basada en la reducción enzimática del NAD+, utilizando la solución reveladora. El revelado implica tres reacciones de óxido reducción sucesivas, la primera es catalizada específicamente por la LDH y las siguientes por el NADH y el reactivo PMS. La presencia de LDH en la tira de acetato de celulosa de electroforesis se visualiza por el precipitado violeta de formazán formado. 

Por inmunoensayo:

Estos métodos aprovechan la afinidad entre la unión de un antígeno con un anticuerpo generado específicamente contra este y son muy útiles para la determinación rápida de la presencia o ausencia de enzimas como la LDH en un tejido particular.

Dependiendo de la finalidad, los anticuerpos empleados deberán ser específicos para la detección de alguna de las isoenzimas o para cualquier proteína con actividad lactato deshidrogenasa.

TIPOCOMPOSICIÓNLOCALIZACIÓN
LDH1HHHHCorazón y eritrocito
LDH2 HHHMCorazón y eritrocito
LDH3 HHMMCerebro y riñón
LDH4  HMMMMúsculo esquelético e hígado
LDH5 MMMMMúsculo esquelético e hígado

Composición y localización de las diferentes isoformas.

5.e. Nuevas dianas terapéuticas: tratamiento del melanoma

Las células cancerosas realizan la glicolisis a un ritmo mucho más rápido que las células sanas. Este fenómeno, denominado “efecto Warburg”, hace que los mecanismos de síntesis de energía estén alterados en las células cancerosas, impidiéndoles emplear las rutas metabólicas de la mitocondria celular.

El fármaco Elesmol causa la muerte de células de melanoma por medio del bloqueo de la fosforilación oxidativa.

Los científicos concluyen que atacar la fosforilación oxidativa en el melanoma es una estrategia prometedora para combatir la fase inicial de la metástasis, antes de que las células cancerígenas pasen a emplear como fuente principal de energía el mecanismo de la glicólisis. 

6. WEBGRAFÍA/BIBLIOGRAFÍA