Luciferasa

Daniel Brihuega, Lourdes Castro, Lucia de la Mata.

Imagenes de los individuos que presentan bioluminiscencia.
Desde arriba a la izquierda: Photinus pyralis, Pholas dactylus, Gaussia princeps y Oplophorus gracilirostris.

La luciferasa es una enzima que pertenece al conjunto enzimático oxidativo de  algunas reacciones de bioluminiscencia. Este fenómeno fue descubierto en el siglo XIX, por el farmacólogo francés Rafaël Dubois, quién observó que la emisión de luz por los distintos seres vivos no era más que una oxidación enzimática, en la que la luciferasa, como él la llamó, era el catalizador; y la luciferina el sustrato. La luciferasa tomó ese nombre del latín lux, lucis que significa ‘luz’ y fero ‘yo llevo’, que describe su papel fundamental en la emisión biológica de luz.

Dicho fenómeno se observó inicialmente en luciérnagas (género Pyrophorus) y en el molusco bivalvo Pholas dactylus, y posteriormente en organismo como: Cnidarios (Renilla reniformis), copépodos marinos (Gaussia princeps), moluscos abisales (Oplophorus gracilirostris), bacterias(…), entre otros.

INVESTIGACIONES SOBRE LA BIOLUMISCENCIA

El fenómeno de la bioluminiscencia ha ido evolucionando a lo largo de la historia gracias al descubrimiento de la primera luciferasa y de su sustrato, la luciferina. A pesar de las infinitas investigaciones que se han llevado a cabo acerca de este complejo proteico, hace apenas unos años que el ser humano aplica la bioluminiscencia en el ámbito sanitario.

Inicialmente, fue el filósofo griego Aristóteles quien se preguntó cómo podían los seres vivos producir luz en su propio organismo, y 300 años más tarde, Plinio el Viejo publicó en la famosa enciclopedia Historia Naturalis sus investigaciones y estudios acerca de aquellos animales bioluminiscentes como las  medusas y moluscos.

Fotografía de Rafael Dubois tomada de la wikipedia

Sin embargo, fue el farmacéutico Raphael Dubois(1849-1929) quien dedicó gran parte de su vida en investigar los compuestos que intervienen en la reacción de bioluminiscencia en el escarabajo Elateridae . Después en 1885, Dubois fue capaz de reproducir dicha reacción en su laboratorio utilizando solamente agua fría y el abdomen de este individuo; denominando a la enzima luciferasa y al sustrato luciferina. Este experimento cobró una mayor importancia cuando posteriormente E.Newton Harvey demostró que dichos compuestos son diferentes en  cada especie.

A partir de este momento, las investigaciones acerca de la bioluminiscencia y la luciferasa aumentaron exponencialmente; así los Drs. Green y McElroy separaron los componentes de la enzima y determinaron su estructura; otros observaron cómo la bioluminiscencia también se podía producir por la activación de una foto-proteína mediante calcio en la medusa gelatina de cristal (Aequorea victoria). Otro gran avance en este campo fue el descubrimiento de un clon de la FLuc (luciferasa de las luciérnagas) en Escherichia coli, por Marlene DeLuca .Esto allanó el camino para próximas investigaciones; siendo los siguientes 30 años los de máximo esplendor en dicho campo. 
De esta manera, en los últimos años, se ha encontrado la Luciferasa en muchos más organismos que los previstos inicialmente, destacando la OLuc (luciferasa de Oplophorus gracilirostris) y la GLuc (Luciferasa de la Gaussia princeps)

ESTRUCTURA DE LA PROTEÍNA

La estructura de la luciferasa de las luciérnagas se determinó por difracción de rayos X, con un porcentaje de observación superior al 96% y una resolución inicial de 2 å. La proteina completa tiene un peso de 62 kD, y el  modelo actual cuenta con 550 residuos de los cuales 523 están determinados junto con 360 moléculas de agua. La luciferasa  está compuesta por una sola cadena que contiene dos dominios, uno en el N terminal y otro en el C terminal. La proteína completa está formada en un 31% de alfa hélices  y un 22% de láminas beta .

El dominio C-terminal es el más pequeño de la proteína y está separado del N-terminal por un largo codo . Este dominio se abre con una α hélice y se cierra por una β lámina que va continuada de un largo codo hasta unirse con el domino N-terminal; formando una “tapa” sobre el barril β. Además se ha llegado a la conclusión de que el largo codo que les separa, posiblemente sea tan largo para permitir cierto nivel de flexibilidad a la hora de plegar la proteína para así poder regular la actividad de la misma. Su estructura interna se ha clasificado como una  estructura α+β (una cadena de laminas β con hélices α intercaladas) y dos láminas β antiparalelas muy cortas.

El dominio-N terminal es mucho más grande y tiene dos subdominios de mayor complejidad; estos son un barril β y una secuencia de β láminas:

  • El subdominio de láminas-β esta compuesto a su vez por otras dos partes muy similares, ambas están formadas por 8 láminas-β (que se disponen a derechas) . La primera agrupación (A) tiene cadenas colocadas de forma paralela y antiparalela con 5 hélices-α asociadas; mientras que la otra agrupación (B) tienen 6 láminas-β paralelas y las otras dos antiparalelas; y al igual que en la agrupación A otras 6 hélices-α intercaladas.
  • El subdominio del barril-β  está compuesto por 3 caras, dos de ellas con tres láminas antiparalelas, de las cuales una forma un puente de hidrógeno; y la última lámina del conjunto B del subdominio de láminas-β. El tercer lado lo forman las dos últimas cadenas (7 y 8) del conjunto B y  el codo que conecta ambas láminas.Esta configuración de barril, que se apoya en un lado de las láminas-β ,crea una cierta curvatura en  la superficie del barril, que acaba convirtiéndose en unos “valles” en forma de Y opuestos a la superficie del dominio C terminal.

PAPEL BIOLOGICO DE LA ENZIMA

El papel biológico más importante de la luciferasa reside en su cualidad como enzima catalizadora de algunos tipos de bioluminiscencia. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia, que consiste en la oxidación de la luciferina, sustancia luminiscente, catalizado por la luciferasa. En comparación con el resto de procesos quimioluminiscentes; ésta tiene un alto rendimiento cuántico, el cual ronda el 100%, mientras que el resto no superan el 0.001 o 0.1%.

El proceso de bioluminiscencia y la estructura de la luciferina son similares para todo tipo de luciferasas, sin embargo las pequeñas diferencias estructurales vienen dadas por el pH de la reacción. 

En el caso de las luciérnagas, es indispensable la presencia de ATP, así la reacción catalizada por la luciferasa de la luciérnaga (FLuc) es:

Esquema de la oxidación. Imagen tomada de [5]

Esta comienza con la luciferina cuyo grupo carboxílico reacciona con el grupo fosfato de ATP, formando el Luciferil adenilato. Esta molécula sufre una oxidación (proceso catalizado por la luciferasa); dando lugar a un peróxido intermedio (complejo luciferasa-luciferina-AMP-O2) que al liberar una molécula de dióxido de carbono da como resultado un cetoderivado, concretamente la oxiluciferina, la cual está excitada, volviendo a su estado normal al desprender un fotón de luz.

 En cuanto a la estequiometría de la reacción, por cada molécula de luciferina se gasta una molécula de oxígeno y  se forma una molécula de dióxido de carbono:

Estequiometría de la reacción. Imagen tomada de [2]

La E es la luciferasa; la LH2 es la luciferina; la PPi es el pirofosfato inorgánico y la P el producto de la reacción.

Se pueden observar dos etapas que limitan  la velocidad de reacción. Éstas ocurren entre la formación del Luciferil adenilato y la emisión de luz; y están relacionadas con el cambio de conformación de la enzima y la reacción del peróxido intermedio para dar oxiluciferina.

La temperatura en la que la reacción está más favorecida es a los 25ºC, ya que a temperaturas mayores la luciferasa se inactiva y a temperaturas más bajas la velocidad de la reacción disminuye.

A lo largo de los años, con el descubrimiento del funcionamiento de la luciferasa y su relación con la bioluminiscencia; el ser humano le ha ido dando numerosas utilidades, desde su uso como técnica analítica para la medición de ATP, hasta el uso de radioisótopos en la técnica analítica de radioinmunoensayo (RIA); pasando por su utilización por los japoneses en la 2º Guerra Mundial como fuente de luz para leer mapas por la noche.

BIBLIOGRAFIA

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  3. GARCÍA RODRÍGUEZ, Carmiña; MARTINEZ MALDONADO, Ivon. Laboratorio de Endocrinología y Biomarcadores, Instituto de Servicios de Laboratorio de Diagnóstico e Investigación en Salud (SELADIS). Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas, UMSA. La Paz – Bolivia.VENTAJAS DEL MÉTODO DE QUIMIOLUMINISCENCIA FRENTE AL DE RADIOINMUNOANÁLISIS (RIA)
  4. P. Franks, A. Jenkins, E. Conti, W. R. Lieb, and P. Brick Biophysics Section, The Blackett Laboratory, Imperial College of Science, Technology and Medicine, London, England. Structural Basis for the Inhibition of Firefly Luciferase by a General Anesthetic N.
  5. Protein Data Bank. https://www.rcsb.org/structure/1lci
  6. http://espiadellabo.com/2013/07/la-luciernaga-y-la-magia-de-los-peroxidos
  7. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006349598776647
  8. http://ansro.blogspot.com/2014/08/ensayo-de-luciferasa-tipos-mecanismos-y.html
  9. https://vrilecologico.wordpress.com/2017/05/20/luciferina-y-luciferasa/