Resultados de prácticas y experimentos

Transformación de metahemoglobina en hemoglobina en columna de sephadex

Columna de sephadex con hemoglobina oxigenada (rojo brillante, abajo) y hemoglobina sin oxigenar (granate, encima)

Para la separación de hemoglobina, usamos un tipo de sephadex con un tamaño de separación inferior a 5 kDa, lo que implica que la hemoglobina (MW 64.5 kDa) no debería ser retenida por la columna y debería salir con el volumen de exclusión (recordad: volumen necesario para eluir una proteína no retenida por la columna). La separación en sephadex nos permite estudiar una de las propiedades interesantes de la hemoglobina: la oxidación del hierro. La transformación de hemoglobina en metahemoglobina es importante también a nivel fisiológico. Por ejemplo, tóxicos como nitritos y nitratos, entre otros, producen metahemoglobinemia (oxidación del hierro del grupo hemo), afectando por tanto al transporte de oxigeno.

Antes de añadir la disolución de metahemoglobina metHb (obtenida oxidando la Hb con ferricianuro), debemos pasar una solución de ditionito (S2O42-), que es un reductor fuerte. El ditionito es adsorbido por la columna, creando un medio reductor. Entonces, al añadir la metHb y comenzar a eluirla, se irá reduciendo gradualmente a Hb. Esta recupera su capacidad de unirse al oxígeno, por lo que irá captando el oxígeno disuelto en el tampón al ir desplazándose por la columna.  Por ello esperamos un cambio de color. El ferrocianuro (con “o”) resultante de la oxidación de la hemoglobina, junto con restos de ferricianuro si estaba en exceso, queda retenido por la columna de exclusión, dado su pequeño tamaño (0.211 kDa), por lo que formará una mancha amarilla en la columna por encima de la hemoglobina.

Fase inicial del experimento. La metahemoglobina (marrón) aun no se ha reducido a hemoglobina. El ferrocianuro, producto del ferricianuro usado en la oxidación de hemoglobina, forma un anillo amarillo retenido por la columna.
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