SDS-PAGE: Electroforesis en gel de poliacrilamida

Version 2. Febrero 2019. C Menor-Salvan.

La técnica de la electroforesis en gel de acrilamida es una de las técnicas básicas mas importantes en el laboratorio de Biología Molecular. Permite la separación de una mezcla de proteínas según su peso molecular y es la técnica de entrada para la realización del Western-Blot, purificación de proteínas para su análisis por espectrometría de masas, estimación de peso molecular o identificación de variaciones en la expresión o estructura de proteínas. Su fundamento físico tiene cierta complejidad, por lo que aquí mostraremos una versión mas simplificada, de interés para los biólogos. Vamos a centrarnos en los fundamentos de la técnica mas que en la práctica, sobre la cual hay numerosos turoriales en video.

Vamos a elaborar la electroforesis según el método desarrollado y refinado por Ulrich Laemmli en los años 1960-70. La idea básica de la electroforesis es la separación de proteínas en un campo eléctrico. Para ello necesitamos dos fuerzas opuestas: el campo eléctrico que va a provocar la movilidad de la proteína en base a su carga, y un soporte sólido que va a retener la proteína en base a su interacción debido al tamaño. La base de la técnica SDS-PAGE es hacer que el movimiento de la proteína en el soporte sólido (gel) por acción del campo eléctrico sea exclusivamente proporcional a su peso molecular. 

Construcción del gel: la polimerización

La electroforesis en gel de poliacrilamida requiere la construcción de un hidrogel (gran cantidad de agua retenida en un soporte molecular altamente poroso y reticulado, resultando un material viscoso, semisólido o un sólido blando). El hidrogel de polímero de acrilamida es el soporte donde tiene lugar la separación de proteínas, gracias a la fricción de las moléculas de proteína con la estructura del gel. Actualmente se puede obtener ya preparado (precast gel), pero sigue siendo usual que se prepare in-situ en el momento de su uso. La preparación del gel se basa en la siguiente reacción:

Reacción de polimerización de la acrilamida. Utilizando la amina TEMED como iniciador, la acrilamida forma largas cadenas de poliacrilamida, entrecruzadas con la bisacrilamida, que aporta reticulación al polímero, regulando su rigidez y porosidad.
estructura de una porción de poliacrilamida
Estructura molecular del gel de poliacrilamida. Fuente: Biomodel UAH

Los componentes implicados en la reacción son:

1- Acrilamida. El monómero fundamental que va a formar el gel. La acrilamida es un compuesto vinílico y, como tal, es susceptible de polimerización por via radicálida. La acrilamida es soluble en agua, no es un compuesto con gran toxicidad aguda, pero en una exposición laboral o exposición continua tiene un efecto acumulativo, es cancerígena (en especial puede inducir cáncer de piel), teratógena y es un neurotóxico. Por ello debe manejarse con precaución. Una vez polimerizada, la poliacrilamida resultante es inocua, ya que ha perdido los grupos vinilo altamente reactivos. De hecho, numerosos cosméticos, como geles fijadores de pelo, llevan polímeros acrílicos similares.

La toxicidad de la acrilamida se debe en parte a la formación de su epóxido, la glicidamida, que reacciona con bases nitrogenadas de los ácidos nucleicos y proteínas, alterando su función o induciendo mutaciones.

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Alteración de purinas de los ácidos nucleicos inducida por glicidamina

2- TEMED y persulfato. Son la clave del mecanismo de polimerización via radicales libres.

Resultado de imagen de acrylamide polymerization mechanism temed
Mecanismo radicálico de formación de poliacrilamida. Imagen tomada de
https://doi.org/10.1016/j.reactfunctpolym.2004.06.004

El TEMED y el persulfato generan los radicales necesarios para iniciar la reacción, que prosigue en cadena hasta formar el hidrogel.

3- N,N’-metilenbisacrilamida: Agente responsable del entrecruzamiento de las cadenas de poliacrilamida y la reticulación del gel. Es esencial para regular las propiedades mecánicas y la capacidad de separación del gel.

Cómo el gel de poliacrilamida puede separar las proteínas.

El gel, una vez preparado en su soporte, nos permite separar una mezcla de proteínas en forma de bandas según su peso molecular: la electroforesis. El proceso global de separación se observa en éste estupendo video, preparado por María Jarabo Arranz (Estudiante de Biología Sanitaria UAH). En el video vemos un gel preparado en su montaje, dentro de una cubeta electroforética donde se establece el campo eléctrico que induce el movimiento de las proteínas en el gel.

Los componentes implicados en el proceso del video son:

  • 1- El propio gel, que consta de dos partes: gel concentrador y gel separador. Nos aporta la fuerza de retención, que va a frenar más las proteínas de mayor peso molecular
  • 2- Los electrodos en la cubeta, que establecen el campo eléctrico que aportará la movilidad electroforética
  • 3- El tampón de electroforesis, que permite la conducción eléctrica y contiene componentes fundamentales en la separación: la glicina y el Tris-HCl
  • 4- La propia muestra, que se prepara utilizando otro componente fundamental: el tampón de carga o de ruptura que a su vez contiene cuatro componentes fundamentales: SDS, mercaptoetanol, glicerol y azul de bromofenol

Vamos a ver detalladamente que ha ocurrido en el video:

Gel concentrador y gel separador. Papel del SDS

La electroforesis SDS-PAGE se diseña de modo que podamos separar las proteínas según su peso molecular. Para ello debemos utilizar una serie de componentes que se incorporan a los tampones utilizados, tanto en la preparación del gel como en la propia electroforesis y en la preparación de la muestra. El más relevante es el SDS.

SDS (lauril sulfato sódico o dodecil sulfato sódico)

Es un detergente muy utilizado, tanto en el laboratorio como en la vida diaria. Lo podemos encontrar en champús y geles o jabones líquidos.

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Su papel es la desnaturalización y el establecimiento de una relación carga-tamaño constante en la proteína, de modo que la movilidad de la proteína durante la electroforesis sea exclusivamente proporcional a su peso molecular. En condiciones nativas, la proteína está plegada según su estructura terciaria y tiene una carga global (positiva, neutra o negativa) que va en función de la composición de aminoácidos, el punto isoeléctrico de la proteína y el pH del tampón en el que se encuentra. Si hiciéramos la electroforesis sin SDS, la proteína tendría una carga global que dependería del pH y el punto isoeléctrico. Al añadir SDS, tiene lugar la siguiente reacción:

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Papel del SDS en la preparación de la proteína para la electroforesis (imagen tomada de aquí)

Como resultado, la proteína adquiere una carga global negativa y directamente proporcional a su tamaño, de modo que la cantidad de SDS que interacciona con la proteína es constante y de unos 1.4 gramos de SDS por cada gramo de proteína. Esto nos garantiza una separación proporcional al peso molecular de la proteína. Como ésta se encuentra desnaturalizada, la interacción con el polímero de acrilamida será mayor cuanto mayor sea el peso molecular. El resultado global es que la velocidad de desplazamiento de la proteína en el campo eléctrico es inversamente proporcional al peso molecular.

Gel separador y concentrador

La separación tiene lugar en el gel separador. Éste gel realiza la separación a un pH 8.8. Antes de que las proteínas entren en el gel separador, pasan por un gel concentrador, a pH 6.8, que evita que las proteínas se dispersen en el gel y provoca que todas las proteínas de las muestras se alineen en una fina banda que entra al mismo tiempo y a la misma velocidad en el gel concentrador.

Separación electroforética. El gel concentrador (stacking) alinea la proteínas en una fina banda que entra al mismo tiempo y velocidad en el gel separador, donde se separan según su peso molecular. Sin gel concentrador, las proteínas formarían un “smear” (un “frenazo” si me lo permitís) en lugar de una banda, perdiéndose la resolución de la separación.

En la separación juega un papel fundamental la glicina y los iones Cl- del tampón, que van entrando en el gel durante la electroforesis. Para entender el papel de la glicina hay que conocer el punto isoeléctrico y los pK de la glicina:

  • pI=6
  • pK1=2.34
  • pK2=9.6

Esto significa que a pH 6, la glicina se encuentra en forma de zwitterion. A pH mayor de 9.6, la glicina está cargada negativamente y a pH por debajo de 2.34 está cargada positivamente. En los pH intermedios, hay carga negativa y positiva, pero a pH<6 la carga neta es positiva y a pH>6 es negativa.

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Distribución de cargas en la glicina

En el gel concentrador, la glicina se encuentra mayoritariamente en forma de zwitterion, aunque prevalece la carga negativa, con lo que la glicina forma una banda que se desplaza lentamente. Por el contrario, los aniones Cl- se desplazan rápidamente, formando una banda gruesa por debajo. Las proteínas se alinean, atrapadas entre la zona rica en glicina y la zona rica en Cl-, debido a la formación de un gradiente electroquímico, en cuya zona central se acumulan las proteínas. El menor porcentaje de acrilamida ayuda en el proceso, ya que se produce menor fricción de las proteínas en el gel.

Papel de la glicina en el proceso. En el gel concentrador, la glicina y el cloruro generan un gradiente de potencial que focaliza las proteínas, colocándolas en una banda fina. Tras alcanzar el gel separador, el pH se aleja del pI de la glicina, que se acumula formando una banda en el frente.

Una vez que alcanzan el gel separador, las proteínas quedan libres del gradiente entre glicina y cloruro que las “atrapa”, debido a que al pH del gel concentrador la glicina tiene principalmente carga negativa (aunque mantiene carga positiva) y ambas (glicina y cloruro) se desplazan rápidamente hacia el ánodo. Las proteínas “liberadas” del “campo de fuerza” o el “rayo tractor” interaccionan con el gel, realizándose la separación.

“¡Capitán, estamos atrapados en un rayo tractor!- Tranquilos, rumbo a la nebulosa poliacrilamida 8.8, donde el rayo no puede actuar”

La glicina sigue jugando un papel importante durante la separación. En el gel separador, el pH está por debajo del pK2 de la glicina, lo que asegura que parte de la población molecular de glicina sigue teniendo cargas positivas. Esto hace que la glicina no desaparezca a toda velocidad, sino que forme una banda que actúa como “barrera”, formando el frente de la electroforesis.

Electroforesis SDS-PAGE de albúmina, preparada por alumnos de 2º de Biología Sanitaria de la UAH. Si el pH del gel separador superase el pK2 de la glicina, ésta se movería a demasiada velocidad, el frente de la electroforesis desaparecería y se perdería la resolución de la separación.

La electroforesis: movilidad electroforética y peso molecular.

La velocidad a la que se mueve una proteína en el gel se define como:

v=µ E

donde v es la velocidad de desplazamiento y E es el campo eléctrico. El parámetro µ se denomina movilidad electroforética

En términos de voltaje, podemos convertir la ecuación en:

v=µ V/D

donde V es el voltaje al que se realiza la electroforesis y D es la longitud del gel separador.

Durante la electroforesis, la partícula proteica está sometida a tres fuerzas principales: la debida al campo eléctrico aplicado (que tira de la proteína hacia el ánodo), la fuerza de retención electrostática, creada debido a la capa de Stern, capa de iones unidos por atracción electrostática a la superficie de la partícula, y la fuerza de fricción de la partícula en el polímero del gel. En el formalismo clásico de Hückel, la movilidad electroforética considera el efecto contrapuesto de la fuerza inducida por el campo eléctrico que “tira” de la partícula y la fuerza debida a la fricción de Stokes, que “retiene” la partícula en el medio viscoso del gel,

Q E=f v; f = 1/ 6 πhR

Donde Q es la carga de la partícula, E el campo eléctrico, f la fricción de Stokes (fricción de una partícula de radio R que se desplaza en un medio viscoso de viscosidad h) y v la velocidad.

y puede definirse entonces la movilidad como:

µ=Q/6 πhR

donde Q es la carga neta, h la viscosidad del medio y R el radio de la partícula proteica que se desplaza. Según esta ecuación, la movilidad depende de la carga neta (a mayor carga, mayor movilidad) y de la fricción de Stokes de la partícula en el gel (a mayor tamaño de la partícula, mayor fricción y menor movilidad y a mayor viscosidad del gel, mayor fricción y menor movilidad).

La teoría de Smoluchowski explica mucho mas detalladamente el fenómeno. Según ésta, podemos definir la movilidad relativa de la partícula como la suma de dos contribuciones:

µF Fext + µE E

µE es la movilidad electrocinética y µF la movilidad no eléctrocinética, que se aproxima a la movilidad de una partícula en un medio viscoso según Stokes: 1/6πhR

La movilidad eléctrocinética fue definida por Smoluchowski como el cociente entre el potencial zeta, o potencial electrocinético, y la constante dieléctrica del medio (e), dividido entre la viscosidad del gel (h).

µE = e Z/h

Es decir, a mayor potencial zeta, mayor movilidad electroforética. El potencial eléctrico de superficie de la partícula en sí mismo se denomina potencial de Nernst. El potencial zeta es el potencial en el límite de la capa de Stern con la zona de fricción de la partícula en el medio. La teoría de Smoluchowski ya nos dice que la movilidad eléctrica no va a depender exactamente de la carga neta de la partícula, sino de su densidad de carga superficial que generará un potencial zeta determinado. Aquí está el meollo: el SDS provoca que el potencial zeta de las partículas proteicas sea el mismo, debido a que genera una densidad de carga superficial constante para todas la proteínas. Por tanto, la movilidad relativa va a depender únicamente de la fuerza de fricción, y, por tanto del tamaño de partícula y su peso molecular y de la viscosidad (o porcentaje de acrilamida) del gel. Viendo la movilidad de Stokes anterior, a mayor peso molecular o mayor viscosidad del gel, menor movilidad relativa.

Equilibrio de fuerzas en una partícula proteica que se desplaza en una electroforesis. El potencial eléctrico en la frontera entre la partícula y la capa de iones unidos electrostáticamente es el potencial de Nernst. En la frontera de la capa de Stern y la zona de fricción se denomina potencial zeta. La movilidad electroforética depende del potencial zeta.

Estimando el peso molecular con la movilidad relativa o migración

En cada electroforesis se incorpora una mezcla de proteínas de peso molecular conocido que sirven como patrón. Este patrón nos permite hacer una estimación de nuestras proteínas de interés. Para ello medimos la movilidad relativa o la migración de la banda de la proteína como:

Rf = distancia migrada por la proteína / distancia migrada por el frente.

Cómo medir la migración o movilidad relativa de la banda de proteína

Una vez que hemos determinado los Rf los patrones, podemos representar gráficamente el logaritmo del peso molecular frente al Rf, obteniéndose una recta. Interpolando en la recta el valor de Rf de la proteína que se está analizando, podemos determinar su peso molecular.

Determinación del peso molecular de una proteína por interpolación de su Rf en la recta patrón obtenida con los marcadores de peso molecular.

Visualizando las proteínas: colorantes

Tras terminar la electroforesis (ver video anterior) no vemos las proteínas de nuestras muestras. Tan sólo los marcadores de peso molecular, que están pre-teñidos. Es el momento de visualizar el resultado. Para ello, uno de los métodos mas sencillos y comunes es la tinción con el colorante azul Coomassie. Este colorante nos permite detectar entre 0.1 y 0.5 µg de proteína en el gel.

El azul Coomassie, formalmente azul brillante Coomassie R-250 o G-250, es un colorante desarrollado en el siglo XIX por la compañía británica Levinstein Ltd. para la tinción textil, específicamente de lana (que está formada por proteína). El nombre de azul Coomassie se debe a que pocos meses antes, los británicos conquistaron la capital del reino Ashanti, en la actual Ghana, llamada Coomassie. El reino Ashanti era uno de los más poderosos de Africa y el único capaz de ofrecer resistencia contra el imperio británico, en una guerra que duró décadas, llamadas las guerras anglo-ashanti. La síntesis del azul de Coomassie coincidió con el final de las guerras y recibió su nombre como conmemoración de la victoria colonial británica.

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Azul Coomassie. Pertenece a la familia de colorantes derivados del trifenilmetano.

En el año 1963, el microbiólogo hungaro-australiano Stephen Fazekas de St. Groth utilizó el azul Coomassie para la tinción de proteínas en electroforesis por primera vez. Desde entonces, se ha convertido en un método de rutina en el laboratorio de Biología Molecular.

El azul de Coomassie se une fuertemente a la proteína por una combinación de atracción electrostática a aminoácidos básicos (histidina, lisina y arginina) e interacciones hidrofóbicas entre fenilalanina y los grupos fenilo del colorante.

Interacción del azul Coomassie con la proteína

Como resultado, si todo ha salido bien, obtenemos unas bonitas bandas de color azul intenso en los sitios del gel donde se encuentra la proteína, lo cual produce una gran satisfacción, pues es una recompensa a muchas horas de trabajo.

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