Toxina del Ántrax

Por Araceli Calderón Brenes, Diego Liviu Boaru Boaru, Pedro Blanco Hernán.

La Bacillus Anthracis es una especie de bacteria dependiente de oxígeno y de tipo Gram+. Pero lo que nos interesa es la toxina que segrega, la toxina del ántrax. Esta tiene un factor de virulencia multifuncional y toma todos los roles de una infección, desde la germinación hasta la muerte por colapso vascular. Además, esta es una proteína, y como tal tiene todas las características que las engloban. (1)

Imagen de Wikipedia Commons

La toxina del Ántrax es una toxina binaria que está constituida por tres polipéptidos: un antígeno protector (PA) y dos restos enzimáticos, los cuales son factor de edema (EF) y factor letal (LF). El PA ante un receptor que se encuentra en la superficie celular del huésped, es capaz de controlar el suministro de EF y LF desde el medio extracelular hasta al hialoplasma de la célula portadora, lo cual genera toxicidad. En esta actividad el PA sufre múltiples cambios estructurales.

Imagen del documento «Caracterización analítica de las toxinas de
Bacillus anthracis cepa Sterne 34F2″ realizado por Lucía Campos y
María Eugenia Pastor. Unión de los factores edema y letal al antígeno protector. (11)

Factor edema (EF)

El EF se encuentra inactivo cuando no está asociado con la calmodulina, este tipo de proteína regula diversos procesos metabólicos y es dependiente de Ca2+. El EF inactivo presenta unas zonas que cuando se unen a la calmodulina aparecen formando una serie de aminoácidos denominados loops . Los “loops” originan un punto de unión para el ATP, el cual se va a desfosforilar y convertir en cAMP, molécula que funciona como mensajero en importantes mecanismo celulares, como la secreción de hormonas. En el EF desactivado uno de ellos está disociado, y se muestra en puntitos, y el otro tiene una orientación distinta. Cuando la calmodulina se asocia, los “loops” originan un punto de unión para el ATP, el cual se va a desfosforilar y convertir en cAMP, molécula importante para la fisiología celular ya que funciona como mensajero en importantes mecanismo celulares, como la secreción de hormonas. Este proceso ocurre de manera descontrolada, por lo que el EF es capaz de sintetizar cantidades ingentes de cAMP, produciendo que la célula se vea obligada a sintetizar una gran cantidad de hormonas, produciendo un desequilibrio químico intracelular que rompe el balance químico normal de la célula. (2)


Imagen de https://pdb101.rcsb.org/motm/28 . A la izquierda vemos el EF desactivado sin la calmodulina (PDB 1k8t ).A la derecha vemos el EF activado con la calmodulina  (amarillo) y con una molécula de ATP. En morado están los los loops ya mencionados (PDB 1jky).

El extremo aminoterminal se une a los demás factores y en el extremo carboxiloterminal se encuentra el centro activo de la enzima, que es lugar de unión del ATP. Los aminoácidos correspondientes para la unión del ATP son la lisina 346 y la lisina 353. Además, para poder funcionar correctamente, el EF utiliza dos metálicos gracias a la histidina 351.

El centro activo se forma por dos dominios, el Ca, que comprende entre los aminoácidos 294-349 y 490-622, y el dominio Cb, que se estructura entre los aminoácidos 350-489. Un tercer dominios en α-hélice, que comprende entre los aminoácidos 660-800, y se conecta con el Ca.  (1)

Además, encontramos tres que participan en la configuración del EF, a los que se les denomina switch A, switch B y switch C, aunque los más importantes son el A y el C. El A comprende entre los aminoácidos 502 y 551 e incluyen residuos que unen la calmodulina con los nucleótidos a ciclar. Este switch A se encuentra dentro del Ca. El switch C, que se comprende entre los aminoácidos 630 y 659, se compone de diversos dominios que anclan el Ca al dominio de α-hélice. Este presenta dos dominios en configuración 𝛽 cuando el EF no está asociado a la calmodulina, pero una vez asociados se convierten en α-hélice. El siwtch B no se encuentra cuando el EF no está asociado a la calmodulina, pero una vez se asocia se hace visible. Este comprende entre los aminoácidos 578 y 591. (3)

factor edema by aracalbre18 on Sketchfab PDB 1jky. En amarillo se señalizan las zonas donde hay estructuras alfa hélice, en lila las beta plegada y en gris las secuencias sin estructuras.

Antígeno Protector

El PA (Protective Antigen) es el componente central de tres componentes de la toxina producido por el B.Anthracis  , que es el órgano responsable de la síntesis del Ántrax. (4)

Tras unirse a los receptores celulares y producirse la activación proteolítica, el antígeno protector forma un preporo heptamérico. Éste sufre una conversión dependiente del pH, transformandose en un poro y ocasionando el desplazamiento de los factores edema y letal al hialoplasma. (11)

Después la activación proteolítica. En la superficie de la célula huésped, el PA forma una inserción membranosa que permite el paso de las proteínas tóxicas, a parte es capaz de dejar pasar proteínas heterogéneas. (Están siendo evaluado su uso como un sistema de transporte general de la proteína). Sus monómeros son laminas ß antiparalelas que tiene cuatro dominios: 

El primer dominio contiene dos iones de calcio y la hendidura o zona de activación de las proteasas. El segundo un giro largo y flexible implicado en la inserción de la membrana. Un tercer dominio cuyo funcionamiento es desconocido.  Y un cuarto dominio de unión a un receptor carboxilo. (5)

antígeno protector by aracalbre18 on Sketchfab PDB 1acc . En amarillo se señalizan las zonas donde hay estructuras alfa hélice, en lila las beta plegada y en gris las secuencias sin estructuras.

1TZO by aracalbre18 on Sketchfab PDB 1tzo. En amarillo se señalizan las zonas donde hay estructuras alfa hélice, en lila las beta plegada y en gris las secuencias sin estructuras.

Factor Letal

El Factor letal tiene una composición mayoritaria de alfa hélice, con 18 estructuras beta plegada y ambas estructuras secundarias están intercaladas con secuencias sin estructura.

 El factor letal es una proteína culminante en lo relacionado con la patogénesis del Antrax.  Es una proteasa cuya secuencia amino terminal corta los miembros de la actividad mitogénica de la proteína quinasa quinasa, produciendo la inhibición de más de una vía de señalización. El factor letal esta constituido por cuatro dominios: 

El primer dominio se ancla a los componentes de traslocacion de la membrana de la toxina, en este caso al PA (antígeno protector). El segundo, tercer y cuarto dominio crean un surco largo y profundo que sujeta la cola N-terminal de 16 residuos. El dominio 3 se une al dominio 2. Se cree que el dominio 3 ha surgido de una duplicación repetida de un elemento estructural del dominio 2 . El dominio 4 contiene el centro catalítico y es similar al dominio 1. La estructura muestra la evolución que ha sufrido la proteína debido a duplicaciones, fusiones de genes y mutaciones.

chimera by aracalbre18 on Sketchfab PDB 1jky. En amarillo se señalizan las zonas donde hay estructuras alfa hélice, en lila las beta plegada y en gris las secuencias sin estructuras.

Imagen del Factor letal proveniente del PDB 1jky  y editado con Chimera. En amarillo se señalizan las zonas donde hay estructuras alfa hélice, en lila las beta plegada y en gris las secuencias sin estructuras.

Papel bioquímico de la toxina del Ántrax

Esta proteína es utilizada por unas bacterias, como es la B.Anthracis,  usando el paradigma enzimático A-B, para las toxinas. Las toxinas binarias producidas por este tipo de bacterias consisten en una serie de componentes que no están asociados físicamente a una disolución y que están vinculadas a enfermedades de animales.

El componente B es sintetizado como precursor, siendo posteriormente activado por proteasas de tipo serina en superficies celulares o en disolución.

Tras la liberación de un péptido n-terminal, los componentes B que fueron activados forman anillos homo-heptamericos que se unen con uno o varios componentes A.

Las moléculas A son las encargadas de desactivar una célula o varias interrumpiendo el cito esqueleto de activa de modo que aumenta los niveles de AMP-cíclico, en el interior de la célula.  (7)

Aspectos evolutivos de la toxina del Ántrax

Hasta 1950 no se consiguió encontrar una toxina letal en las B.Anthracis  ni en los filtrados de los cultivos de los laboratorios que fuese la responsable de la muerte de muchas especies de animales. 

Durante esa misma década, se logró reconocer una toxina mientras se examinaba bacterias y productos que se habían obtenido de conejillos de indias que morían de Ántrax.

La toxina se encontraba en el plasma de la bacteria, y se dijo en un principio que tenía dos componentes, sin embargo, al trasladarla en un cultivo in vitro, lograron ver un tercer elemento. Este descubrimiento demostró que las toxinas podrían estar formadas por varios componentes. 

Gracias a este trabajo se demostró que había determinantes desconocidos en los patógenos bacterianos que podían observarse al examinar los organismos cultivados in vitro.

La falta de similaridad estructural con la enzima de los mamíferos,combinada con el mecanismo de 2 iones metálicos catálisis prevaleciente en la enzima que cicla el AMP en los mamíferos sugiere un mecanismo convergente en la evolución. (8)

Alteraciones relacionadas con la salud

La investigación contra el cáncer está a la orden del día. Los investigadores buscan cientos de maneras distintas para combatir esta enfermedad que mata a miles de personas al cabo del año. Hay ciertas líneas de investigación y una de ella trabaja con la proteína que tratamos en este nuestro blog, el ántrax, gracias a la especificidad del PA con su receptor. Recordemos que la acción del PA era asociarse con su receptor y formar un poro para introducir al citoplasma el LF y el EF, cuya estructura se ha descrito anteriormente.

El mecanismo que han utilizados los laboratorios de Laboratory of Parasitic Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 20892, USA fueron los siguientes. Para atacar a los tumores, el LF fue modificado:

  • Se conservó el extremo aminoterminal del dominio que se une al PA mediante el aminoácido 254, que se denomina LFn.
  • El dominio catalítico de la exotoxina A del microorganismo Pseudomonas aeruginosa, que denominamos PEIII.

Gracias a estas modificaciones obtenemos la proteína FP59. Esta proteína entra a las células tumorales mediante el PA, y una vez entra en el citosol activa un mecanismo en cadena capaz de destruir la célula desde dentro. Lo primero es que el LFn libera al PEIII, el cual transfiere un ADP-ribosa al factor de elongación eEF2 (10), inhibiendo así la síntesis proteica y destruyendo la célula. Este mecanismo se ha probado en diferentes tipos de tumores y se espera que funcione en todos ellos.

Uno de los mayores problemas que encontramos es que casi todas las células del organismo presentan el receptor para el PA, por lo que la combinación de la proteína FP59 y el PA es altamente tóxica para casi todas las células del organismo. (9)

BIBLIOGRAFÍA.

1. Microbial Toxins: Current Research and Future Trends

2. Anthrax Toxin. Anthrax bacteria build a deadly three-part toxin. https://pdb101.rcsb.org/motm/28

3. Chester L. Drum, Shui-Zhong Yan, Joel Bard, Yue-Quan Shen, Dan Lu, Sandriyana Soelaiman, Zenon Grabarek, Andrew Bohm & Wei-Jen Tang. “Structural basis for the activation of anthrax adenylyl cyclase exotoxin by calmodulin”.

4. Carlo Petosa, R. John Collier, Kurt R. Klimpel, Stephen H. Leppla & Robert C. Liddington. «Crystal structure of the anthrax toxin protective antigen».

5. Debasis Das, Bryan A. Krantz. «Secondary Structure Preferences of the Anthrax Toxin Protective Antigen Translocase».

6. Andrew D. Pannifer, Thiang Yian Wong, Robert Schwarzenbacher, Martin Renatus, Carlo Petosa, Jadwiga Bienkowska, D. Borden Lacy, R. John Collier, Sukjoon Park, Stephen H. Leppla, Philip Hanna & Robert C. Liddington. «Crystal structure of the anthrax lethal factor».

7. Holger Barth, Klaus Aktories, Michel R. Popoff, Bradley G. Stiles. «Binary Bacterial Toxins: Biochemistry, Biology, and Applications of Common Clostridium and Bacillus Proteins».

8. Harry Smith. «Discovery of the anthrax toxin: the beginning of studies of virulence determinants regulated in vivo».

9. Christopher Bachran, Pradeep K. Gupta, Silke Bachran, Clinton E. Leysath, Benjamin Hoover, Rasem J. Fattah & Stephen H. Leppla. “Reductive Methylation and Mutation of an Anthrax Toxin Fusion Protein Modulates its Stability and Cytotoxicity”

10. Yates SP, Merrill AR. “Elucidation of eukaryotic elongation factor-2 contact sites within the catalytic domain of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A”

11. Lucía Campos, María Eugenia Pastor. «Caracterización analítica de las toxinas de Bacillus anthracis cepa Sterne 34F2″